保持细胞应力平衡条件下检测SSBs结合状态的装置及方法制造方法及图纸

本发明专利技术公开了一种保持细胞应力平衡条件下检测SSBs结合状态的装置及方法，该装置包括：圆管细胞电泳槽，管壁中部，沿其纵轴方向开有一矩形槽口，电泳缓冲液池，侧连接通道，滤膜，孔径为0.2μm或0.45μm亲水聚苯醚砜滤膜，所述电泳缓冲液池与侧连接通道铸成一体，侧连接通道与电泳槽通过可拆卸的方式密封连接，滤膜插在侧连接通道与电泳槽的连接处。本发明专利技术的装置能够使细胞在保持原细胞结构完整性的条件下分离结合态SSBs与非结合SSBs。本发明专利技术巧妙的将细胞原位电泳与细胞流式分析术结合，检测结果准确。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种保持细胞应力平衡条件下检测SSBs结合状态的装置及方法。
技术介绍
单链DNA结合蛋白(singlestrandDNA-bindingproteins,SSBs)包括replicationproteinA(RPA)和端粒保护蛋白protectionoftelomeresprotein1(POT1)。当DNA复制的时候，双链DNA需要解旋成单链DNA并且与单链DNA结合蛋白结合来防止形成错误结构，维护端粒及基因组的稳定性。然而，已分化了的正常体细胞在非生理的化学、物理以及炎症因素干预下，细胞会从其生长的基质上脱离，其细胞核会产生剧烈的缩小，与此同时，与SSBs结合的染色质/DNA会受到这种缩小和拥挤的细胞核的压迫，从而产生适形变化,产生适形变化的SSBs会从单链DNA上脱离。将脱离结合状态的SSBs在保持细胞完整性的条件下，使其从细胞中分离出来，并且保持分离出的SSBs不会重新进入细胞，至今没有这样的装置。众所周知，DNA是生物体遗传密码-基因的载体，基因组的稳定性对生物体的生物学行为是至关重要的。基因组的不稳定性或基因的变异与人类众多疾病密切相关，如癌症、衰老等等。而SSBs存在于一切真核生物细胞，SSBs的结合状态对保证DNA的正确复制、DNA的损伤修复以及基因组的稳定性具有关键性的作用。然而目前未发现有关技术手段和实验方法能够实现对结构完整且保持其应力平衡的细胞核内部的SSBs结合状态进行检测的文献报道。<br>
技术实现思路
本专利技术的目的就是为了提供一种保持细胞应力平衡条件下检测SSBs结合状态的装置及方法。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种保持细胞应力平衡条件下检测SSBs结合状态的装置，包括：细胞电泳槽：该槽为内径0.76～0.84cm(优选0.8cm)、外径0.90～1.00cm(优选0.95cm)、长度18.9～17.1cm(优选18cm)的聚苯乙烯圆管，管壁中部，沿其纵轴方向开有一8.55×0.57cm～9.45×0.63cm(优选9×0.6cm)的矩形槽口；电泳缓冲液池：阳极、阴极各有一个，尺寸相同，9.5×3.33×4.75cm～10.5×3.68×5.25cm(优选10×3.5×5cm)；材质：聚苯乙烯；侧连接通道：阳极与阴极侧各有一个，尺寸相同，内径0.76～0.84cm(优选0.8cm)，外径0.90～1.00cm(优选0.95cm)，长9.5～10.5cm(优选10cm)的硅胶管；滤膜：阳极与阴极侧各有一个，尺寸相同，0.45μm或0.2μm亲水聚苯醚砜(Hydrophilicpolyethersulfone)滤膜；电极：阳极与阴极各有一根，5.7～6.3cm(优选6cm)长，直径0.475～0.525cm(优选0.5mm)电泳仪用铂丝。细胞原位电泳(cellinsituelectrophoresis,CISE)，是将待检细胞制备成单细胞悬液，使其单个游离的细胞分散于等渗即应力平衡的介质中，在电场作用下，将细胞中的物质从细胞中分离出来的一种电泳方式。上述保持细胞应力平衡条件下检测SSBs结合状态的装置，为水平式电泳装置。利用上述装置检测SSBs结合状态的方法，具体包括以下步骤：细胞预固定：分离处理生长期细胞，加入磷酸盐缓冲液(PBS)制成细胞悬液，将上述细胞悬液涂布于培养皿底部，将上述培养皿置于0℃条件下用UV灯照射(优选254nmUV灯以1.84W/cm2强度照射，总剂量165.6J/cm2)后，用磷酸盐缓冲液(PBS)收集培养皿中的细胞，离心(260g离心5min)弃上清液后加入4％多聚甲醛预固定1-6(优选3)sec；预固定的目的为：既有应力结构以及细胞内待检蛋白非变性的状态下，经受细胞原位电泳过程，而不发生破碎，以保持细胞完整性，以方便接下来的打孔。细胞打孔：将上述预固定的细胞，加入打空剂，所述打空剂能够使细胞膜和细胞核都打孔，优选聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)，浓度为0.2％，细胞打孔时间5-15(优选10)min；打孔的目的为：溶解细胞生物膜上的脂质，使单链DNA结合蛋白能够从细胞中移出，以方便脱落的单链结合蛋白从细胞中移出，不破坏细胞的整体结构。细胞原位电泳(cellinsituelectrophoresis，CISE)：将上述打孔后的细胞团加入CISE缓冲液(三羟甲基氨基甲烷Tris25mM；甘氨酸Glycine:192mM；葡萄糖Glucose：43.2mM；pH8.3)制成细胞悬液，恒压模式下，在电泳槽阴极侧滴入细胞悬液，电泳完成后用移液器吸净电泳槽中的液体，并将吸出液汇集于一离心管中，用电泳缓冲液冲洗电泳槽，重复电泳过程，直至细胞悬液全部完成电泳；在电泳条件下，从DNA单链上脱落的单链结合蛋白通过细胞上的孔道流出，从而实现脱落的单链结合蛋白与未脱落的单链结合蛋白的分离；优选点样时，细胞样品点在中间泳道距离阴极端1.5cm处(目的是：电泳时，防止细胞移动至滤膜处从而聚集成团)，保证电泳时细胞不破裂，且减少了单链DNA结合蛋白从一个细胞移出后再通过细胞上的孔道进入另一个细胞的概率。电泳的时间优选为3min。检测：使用流式细胞术分析检测。本专利技术中所用到的PBS，pH值都为7.4。本专利技术的有益效果：在预固定时，将上述培养皿置于0℃条件下用UV灯照射，强化了SSBs原有的状态，保证后续检测结果的准确。本专利技术的装置能够使细胞在保持应力平衡状态的条件下分离结合态SSBs与非结合SSBs。本专利技术制备的电泳缓冲液可以保持细胞等渗，保证细胞完整，选用Glucose是因为其无极性，且分子结构不影响后续的离心，便于细胞的回收。本专利技术巧妙的将细胞原位电泳与细胞流式分析术结合，检测结果客观准确。本专利技术的装置结构简单、操作方便和分析结果客观的特点。应用本专利技术方法对SSBs结合状态的检测，呈现出易于判断的“保持结合”与“出现解离”两种结果。本专利技术装置的使用应力改变所致细胞核缩小造成的SSBs解离具有重要的生物学意义。其级联过程以及生物学效应可概括为：细胞收缩-细胞核压缩-染色质适形变化所导致的基因组不稳定性。本专利技术采用了首先用4％的多聚甲醛200μl秒级预固定，在进行流式分析前又用70％的乙醇15ml进行二次固定，保证了细胞在后期的流式分析中细胞的完整，同时使得流式分析结果的准确性。用本专利技术技术原创性发现的导致内源性基因组不稳定的分子机制属于生命科学基础层面上的自然规律。它对于揭示许多重大疾病(如癌症、衰老退化性疾病-阿尔茨海默症本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种保持细胞应力平衡条件下检测SSBs结合状态的装置，其特征在于，包括：细胞电泳槽：该槽为一内径0.76～0.84cm、外径0.90～1.00cm、长度18.9～17.1cm的圆管，管壁中部，沿其纵轴方向开有一8.55×0.57cm～9.45×0.63cm的槽口；电泳缓冲液池：阳极、阴极各有一个，尺寸相同，9.5×3.33×4.75cm～10.5×3.68×5.25cm；侧连接通道：阳极与阴极侧各有一个，尺寸相同，内径0.76～0.84cm，外径0.90～1.00cm，长9.5～10.5cm；滤膜：阳极与阴极侧各有一个，尺寸相同，0.2μm或0.45μm亲水聚苯醚砜滤膜。

【技术特征摘要】
1.一种保持细胞应力平衡条件下检测SSBs结合状态的装置，其特征在于，包括：细胞
电泳槽：该槽为一内径0.76～0.84cm、外径0.90～1.00cm、长度18.9～17.1cm的圆管，管
壁中部，沿其纵轴方向开有一8.55×0.57cm～9.45×0.63cm的槽口；电泳缓冲液池：阳极、阴
极各有一个，尺寸相同，9.5×3.33×4.75cm～10.5×3.68×5.25cm；侧连接通道：阳极与阴极侧
各有一个，尺寸相同，内径0.76～0.84cm，外径0.90～1.00cm，长9.5～10.5cm；滤膜：阳
极与阴极侧各有一个，尺寸相同，0.2μm或0.45μm亲水聚苯醚砜滤膜。
2.如权利要求1所述的装置，其特征在于，所述细胞电泳槽内径0.8cm、外经0.95cm、
长度18cm的圆管，管壁中部，沿其纵轴方向开有一9×0.6cm槽口；电泳缓冲液池：阳极、
阴极各有一个，尺寸相同，10×3.5×5cm；所述侧连接通道，阳极与阴极侧各有一个，尺寸
相同，内经0.8cm，外经0.95cm,长10cm；滤膜，阳极与阴极侧各有一个，尺寸相同，孔
径为0.45μm亲水聚苯醚砜滤膜。
3.如权利要求1或2所述的装置，其特征在于，所述细胞电泳槽和电泳缓冲液池的材质
为聚苯乙烯，所述侧连接通道为硅胶管。
4.如权利要求1所述的装置，其特征在于，所述装置为水平式电泳装置。
5.一种保持细胞应力平衡条件下检测SSBs结合状态的方法，具体包括以下步骤：
(1)细胞预固定：分离细胞，加入磷酸盐缓冲液制成细胞悬液，将上述细胞悬液涂布于
培养皿底部，将上述培养皿置于≤0℃条件下用UV灯照射后，用磷酸盐缓冲液收集培养皿中
的细胞，离心弃上清液后加入4％的多聚甲醛预固定1-6sec，预固定完成后加入打空剂，所述
打空剂能使细胞膜和细胞和都打孔，打孔5-15min；
(2)细胞原位电泳：将上述打孔后的细胞团加入电泳缓冲液制成细胞悬浮，恒压模式下，
在电泳槽阴极侧滴入细胞悬液，电泳完成后用移液器吸净电泳槽中的液体，并将吸出液汇集
于一离心管中，用电泳缓冲液冲洗电泳槽，重复电泳过程，直至细胞悬液全部完成电泳；
(3)检测：使用流式细胞术分析检测。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中用254nmUV灯以1.84W/cm2强度照射，总剂量165.6J/cm2。
7....

【专利技术属性】
技术研发人员：国前，于金明，廖湘鲁，
申请(专利权)人：山东省肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：山东;37