本发明专利技术提供了一种大豆花特异启动子GmAP1.4，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。还提供了所述启动子在调控下游基因表达中的应用。利用启动子GmAP1.4过表达拟南芥GUS基因，结果表明启动子GmAP1.4可明显促进植物花器官中GUS基因的表达量，因而，GmAP1.4启动子在植物花器官中具有特异性，适合在各种作物、林木、蔬菜、花卉、牧草等植物的花中特异表达目标基因。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学、基因工程
，具体地，涉及一种大豆花特异启动子 GmAP1.4及其应用。
技术介绍
启动子是基因中重要的顺式作用元件，一般位于转录起始位点上游几十个碱基 处。 启动子根据转录模式不同可分为三种：组成型启动子、组织或器官特异性启动子 和诱导型启动子。组织或器官特异性启动子的活性是受特定的组织细胞结构和化学、物理 信号诱导调节的，即这类启动子的表达具有特定的时空性。在这类启动子的驱动下，基因的 表达往往只限于某些特定的器官或组织部位或特定的发育时期。组织或器官特异性启动子 不仅能使目的基因的表达产物在一定器官或组织部位积累，提高区域表达量，同时也可以 避免目标基因在其他组织器官中表达造成的不利影响。 到目前为止，已有大量的组织或器官特异性启动子被分离出来，其中包括花特异 启动子和种子特异启动子。如花粉发育有关的组织特异性启动子如TA29、Lat52、0sg6B、 Zml3、Sl等已有详细研究报道;UBC6启动子(1&?8，1994)主要在花中表达汀8?1是水稻中绒 毡层特异启动子（马沁沁，2005);DefH9是子房特异启动子(Rotino，1997);PtNIPl是柏树胚 胎发育特异性启动子(Vincent，2002)。这些启动子都能特异启动目标基因的表达，改变特 异组织器官的发育。但大豆中花特异表达的启动子鲜有报道。 成花过程是植物从营养生长向生殖生长的关键转折期，包括开花诱导、花的发端 和花器官发育三个阶段，受众多基因调控。调控植物成花过程的基因可分为:花序分生组织 特征基因、花分生组织特征基因、花器官形态特征基因等。API (APETALA1)基因属于植物花 分生组织特征基因和花器官形态特征基因，在控制植物花分生组织特性与花器官的形成过 程中起着重要的作用。 因此有必要研究和获得调控大豆花API的启动子序列，从而为深入研究植物成花 过程、花的发端和花器发育提供有效手段和途径。
技术实现思路
本专利技术的目的在于获得调控大豆花API基因的启动子序列，从而为在各种作物、林 木、蔬菜、花卉、牧草等植物的花中特异表达目标基因提供有效途径。 为达到以上目的，本专利技术提供了一种大豆花特异启动子GmAPl .4,其具有： a)SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列；或 b)SEQ ID No. 1所示核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸所获得 的具有同等功能的由a)衍生的核苷酸序列。例如，在不改变启动子功能的情况下，进行以下取代方式中的至少一种所获得的 核苷酸序列：将第26位的C取代为T，将第213位的C取代为T，将第2375位的G取代为A，将第 2387位的T取代为C。本专利技术还提供了从拟南芥基因组中克隆得到2500bp的GmAPl.4启动子序列所用的 特异性引物序列，其包括正向引物:5 ' -TATGCACTTTCTACTTCGGTTTGGC-3 ' ；和反向引物:5 ' -GATGACAAGTGGTTTTGGTTTCTGG-3'。本专利技术还提供了含有启动子GmAPl.4的载体以及含有所述载体的宿主细胞。 本专利技术还提供了含有启动子GmAPl .4的转化植物细胞。 本专利技术还提供了启动子GmAPl.4在调控下游基因表达中的应用，优选下游基因为 GUS基因。 本专利技术还提供了启动子GmAPl.4在植物花发育调节中的应用。在本专利技术中，可选用本领域已知的各种载体，只要适合启动子GmAPl. 4的表达即 可，例如可以为市售的载体及质粒。 本专利技术首次分离了大豆花特异启动子GmAPl. 4，利用启动子GmAPl.4过表达拟南芥 GUS基因，结果表明启动子GmAPl.4可明显促进植物花器官和胚胎中GUS基因的表达量，因 而，GmAPl. 4启动子在植物花器官具有特异性，适合在各种作物、林木、蔬菜、花卉、牧草等植 物的花中特异表达目标基因。【附图说明】图1为质粒BDV1的结构示意图；图2为拟南芥GmAPl.4-GUS在花器官(雌蕊）中的表达结果；图3为拟南芥GmAPl. 4-GUS在花器官(雄蕊）中的表达结果； 图4为拟南芥GmAPl.4-GUS在花器官(花瓣)中的表达结果； 图5为拟南芥GmAPl.4-GUS在花器官(花萼）中的表达结果；；图6为拟南芥GmAPl .4-GUS在花中的表达结果；图7为拟南芥GmAPl .4-GUS在花序中的表达结果； 图8为拟南芥GmAPl .4-GUS的PCR检测结果。【具体实施方式】下面结合【具体实施方式】对本专利技术进行详细说明。 以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明，实施例 中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。 实施例1 本实施例用于说明大豆GmAPl .4启动子的克隆 利用正向引物5 ' -TATGCACTTTCTACTTCGGTTTGGC-3 ' 和反向引物5 ' -GATGACAAGTGGTTTTGGTTTCTGG-3'从大豆基因组中PCR扩增并测序获得长度为2500bp的 GmAPl.4启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。 上述PCR扩增体系为：（20μ1体系） PCR 程序： 实施例2 本实施例用于说明大豆GmAPl .4启动子调控下游基因⑶S的表达情况。 将GmAPl.4启动子克隆至入门载体并与⑶S基因融合，然后将获得的融合基因构建 至表达载体BDV1。 过程如下:PCR克隆得到GmAP1.4启动子后，通过Solution I连接至带有GUS基因的 入门载体，并与之融合。采用GateWay重组克隆的方法（Invitrogen)，通过LR反应将启动子 及⑶S基因重组至目的载体BDV1上。BDV1的结构如图1所示、 获得双元表达载体pGmAPl. 4: : GUS;将植物表达载体pGmAPl. 4: : GUS转化至大肠杆 菌DH5a中扩繁。大肠杆菌感受态细胞的转化，包括：（1)制备含氨苄青霉素的LB固体培养基； (2)取出贮存于-80°C的感受态细胞，冰浴中融化后，加入2μ1质粒轻轻混匀，冰浴中放置30 分钟；（3)42°C热激30秒，然后立即置于冰浴中3分钟；加入300μ1不含抗生素的LB液体培养 基，37°C摇床振荡培养1小时（160rpm);(4)取适量培养液均匀涂于选择性培养基上，37°C倒 置培养16小时，用灭菌牙签挑取5-10个(或更多)菌落，置于200μ1选择性液体LB培养基中摇 菌培养；（5)PCR检测筛选到的阳性克隆（图8)。通过农杆菌介导转化方法，将pGmAPl. 4: : GUS 转入拟南芥，获得转化pGmAPl. 4: :GUS的拟南芥2株;通过⑶S活性分析表明，GmAPl. 4启动子 在植物的雌蕊(图2)、雄蕊(图3)、花瓣(图4)、花萼（图5)、花(图6)及花序(图7)中特异表达， 可用于包括各种作物、林木、蔬菜、花卉、牧草等在内的各种植物的花和胚胎中特异表达目 标基因。 拟南芥⑶S染色： (1)将组织样品加入90%丙酮中，置于冰上20~30分钟； (2)经丙酮处理后，用50mM磷酸缓冲液(pH7.2)、2mM K4Fe6及2mM K3Fe6溶 液润洗组织； (3)将样品放在X -Glue染色液中（50mM磷酸缓本文档来自技高网...
【技术保护点】
大豆花特异启动子GmAP1.4，其特征在于，其具有：a)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；或b)SEQ ID No.1所示核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸所获得的具有同等功能的由a)衍生的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：傅永福，张晓玫，陈福禄，宋拉拉，
申请(专利权)人：中国农业科学院作物科学研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。