植酸酶变体制造技术

本发明专利技术的发明专利技术名称是“植酸酶变体”，属于生物技术领域，所要解决的技术问题是提供编码植酸酶变体的氨基酸序列和编码植酸酶的核苷酸序列及其应用，解决该问题的技术方案是提供了相应的序列及其应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及植酸酶变体，编码植酸酶变体的氨基酸序列和编码植酸酶的核苷酸序 列及其应用。
技术介绍
在谷物和豆类中，磷主要以植酸或植酸盐（Phytate)的形式储存。植酸又称肌 醇六磷酸，含有6个磷酸基团，带有丰富的磷，植酸是饲料中磷的重要贮存形式。植酸酶 (EC3. 1. 3. 8)即肌醇六磷酸水解酶，催化植酸及植酸盐水解成肌醇与磷酸。 磷是动物生长的必需元素。单胃动物如猪、家禽和鱼不能直接吸收植酸盐，导致大 量植物来源的磷元素排放于环境中，造成环境富营养化。同时，动物吸收磷酸盐不足会影响 生长，为了补偿这些动物的磷酸盐的缺乏，需在饲料中补充磷酸盐，增加了养殖成本并加剧 了对环境的不利影响。通过在动物饲料中使用植酸酶，水解了植酸盐，可改善动物对磷的吸 收，并降低磷排放。因此，植酸酶具备一举两得的功效，已在动物饲料中普遍应用，具有十分 重大的经济价值。 自然界中植酸酶的来源多种多样。通过基因工程手段，特别是DNA重组技术的应 用，使各种微生物来源的植酸酶大规模廉价生产和实际应用成为可能。现工业化生产的植 酸酶主要有来源于黑曲霉的真菌植酸酶和来源于细菌的植酸酶两种。其中来源于黑曲霉的 植酸酶PHYA具有高耐热性及良好的消化道稳定性等特点。目前主要通过在粉末饲料直接 添加或颗粒饲料后喷涂的方法应用在饲料行业。 在颗粒饲料生产过程中有一个短暂的80-90°C的造粒过程。黑曲霉来源的植酸酶 耐热性良好，能够抵抗住上述短时高温过程。但由于黑曲霉来源的植酸酶比活性较低，相比 细菌来源的植酸酶比活性相差较大，因此进一步提高黑曲霉来源的植酸酶的比活性从而提 升发酵活力，是饲用植酸酶的研究热点之一。同时，进一步提升耐热性，降低造粒时的酶活 损失，也是饲用植酸酶的重要研究方向。【附图说明】 图1显示含本专利技术所述植酸酶变体的重组载体pPHYA(即pPICZ a -phyA)。 图2显示来源于黑曲霉的野生型植酸酶的氨基酸序列SEQ ID NO: 1。括号内为植 酸酶的原始信号肽序列，不含在本专利技术范围之内，字母带框的为突变位点。 图3显示编码植酸酶氨基酸序列SEQ ID No: 1的经密码子优化的核苷酸序列，所 述植酸酶从第20位氨基酸开始，不含信号肽序列。
技术实现思路
本专利技术通过基因突变的方法对黑曲霉来源植酸酶的氨基酸序列进行改造，使改造 后的植酸酶具有提高的比活性或者耐热性能。构建表达载体和菌株，使改造后的植酸酶高 效表达，最终达到工业化生产的要求。 本专利技术是以黑曲霉植酸酶PHYA为起始植酸酶进行突变筛选。来源于黑曲霉的植 酸酶PHYA基因全长1401bp(GeneBank号码：P34752)，编码467个氨基酸（参见例如SEQ ID NO: 1中所示）。N端的19个氨基酸为信号肽，去除信号肽的黑曲霉植酸酶可以利用毕赤酵 母进行分泌表达获得具有植酸酶活性的成熟蛋白。 在一个实施方案中，本专利技术的植酸酶变体，相对于野生型植酸酶的氨基酸序列SEQ ID No:l而言，具有选自以下的至少一个位点的氨基酸修饰：位点51、84、86、91、126、165、 202、211、和300。优选地，所述的氨基酸修饰选自：￥513，1'(￥513，1'表示第51位的氨基酸 残基 Y 优选 S 或 T 进行替换，以下同）；A84R，S，G ;Y86P，G，W ;K91N，T，V，A, G，S，M ;D126E，N ; R165K, W ;E202D, Q ;D211K ;和 Κ300Ε, G, L, I，V，Μ。 在一个实施方案中，本专利技术还涉及上述植酸酶变体的保守取代变体。优选地，所述 的保守取代变体保留本专利技术植酸酶变体的提高的比活性和/或耐热性。对于本领域的技 术人员而言很明显，这种取代可以在上述位点以外的区域发生，而仍保留相应活性。优选 地，所述保守取代变体具有至少一个位置的氨基酸保守取代。保守取代的实例是在下列氨 基酸组内发生的取代：碱性氨基酸（如精氨酸、赖氨酸和组氨酸）、酸性氨基酸（如谷氨酸 和天冬氨酸）、极性氨基酸（如谷氨酰胺、天冬酰胺）、疏水性氨基酸（如亮氨酸、异亮氨酸 和缬氨酸）、芳香氨基酸（如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸），以及小分子氨基酸（如甘氨酸、 丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸）。最常见的氨基酸互换有氨基酸G至A ;Α至G，S ;V 至 I，L，A, T，S ;1 至 V，L，M ;L 至 1，M，V ;M 至 L，I，V ;P 至 A, S，N ;F 至 Y，W，Η ;Y 至 F，W，H ;W 至 Y，F，H ;R 至 K，E，D ;K 至 R，E，D ;H 至 Q，N，S ;D 至 N，E，K，R，Q ;E 至 Q，D，K，R，N ;S 至 T，A ;T 至 S，V，A ;C至S，T，A ;N至D，Q，H，S ;Q至E，N，H，K，R的互换，以及它们的相反的互换。 在一个实施方案中，本专利技术还涉及与上述植酸酶变体的氨基酸序列具有一定的氨 基酸同源性的植酸酶变体，例如，同源性至少约80%，更优选至少约81%，更优选至少约 82%，更优选至少约83%，更优选至少约84%，更优选至少约85%，更优选至少约86%，更 优选至少约87 %，更优选至少约88 %，更优选至少约89 %，更优选至少约90 %，更优选至少 约91 %，更优选至少约92%，更优选至少约93%，更优选至少约94%，最优选至少约95%, 最优选至少约96 %，最优选至少约97 %，最优选至少约98 %，最优选至少约99 %，只要具有 所述同源性的变体保留本专利技术植酸酶变体的提高的比活性和/或耐热性。 在本文中，"保留本专利技术植酸酶变体的提高的比活性和/或耐热性"是指，保留本发 明植酸酶变体的比活性和/或耐热性的至少约20%，优选至少约30%，更优选至少约40%， 更优选至少约50%，更优选至少约60%，更优选至少约70%，更优选至少约80%，更优选至 少约90%，最优选100%。 本专利技术同时提供了一种提高比活性或者耐热性的方法，该方法包括：在野生型 植酸酶或与野生型植酸酶氨基酸序列相似性超过90 %以上植酸酶氨基酸序列中引入一 个或多个氨基酸突变来提高比活性或者耐温性。例如，在植酸酶的第51、84、86、91、126、 165、202、211、300 位。优选 Y51S, T ;A84R, S, G ;Y86P, G, W ;K91N, T, V，A, G, S, M ;D126E, N ; R165K, W ;E202D, Q ;D211K ;Κ300Ε, G, L, I，V(Y51S, Τ 表示第 51 位的氨基酸残基 Υ 优选 S 或 Τ 进行替换，以下同）。 另一方面，本专利技术提供了本专利技术所述植酸酶的编码基因。 在一个优选实施方案中，所述野生型植酸酶的编码基因具有SEQ IDNo:2所示的 核苷酸序列，其不包括野生型植酸酶的信号肽序列。该核苷酸序列根据表达宿主酵母偏爱 密码子设计，有效提高该基因的表达效率。该序列在起始密码子后或蛋白表达系统正确阅 读框内编码成熟的植酸酶。所有的位点突变优选在上述密码子优化后的基因序列基础上进 行。 另一方面，本专利技术提供了一种改良的植酸酶的制备方法，该方法包括：编码基因的 合成或克隆，重组载体的构建，受本文档来自技高网...

【技术保护点】
植酸酶变体，其与野生型氨基酸序列SEQ ID No:1相比，具有在选自以下的至少一个位点的氨基酸修饰：位点51、84、86、91、126、165、202、211、和300。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李峰，李凤梅，王忆平，
申请(专利权)人：北京大学，众望百奥生物科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11