本发明专利技术提供一种从黄绿蜜环菌中提取抗肿瘤活性组分的方法，包括以下步骤：黄绿蜜环菌子实体磨粉后乙酸乙酯提取；取上清进行一维液相分离，采用Silica正相硅胶色谱柱，A相正己烷、B相乙醇二元有机相，B相浓度由0％至75％梯度洗脱；收集10-14min洗脱液进行二维液相分离，洗脱方式为B相浓度4-8％等度洗脱；收集6-8min洗脱液进行三维液相分离，洗脱方式为B相浓度2-3％等度洗脱，收集7.5-12min洗脱液并蒸干得目的产物。该方法采用高效液相色谱进行分离纯化，重复性高，制备量大，操作简单省时。实验发现该化合物对Hep-g2具抑制作用，故具有抗癌药物开发潜力，为新药研发提供理论依据。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及药物化学及生物医药
，具体涉及一种从黄绿蜜环菌中提取抗肿瘤活性组分的方法，以及该抗肿瘤活性组分在制备抗肝癌药物中的应用。
技术介绍
黄绿蜜环菌(41'111；.2010,16(3):52-54)。国内对黄绿蜜环菌营养成分进行了初步分析，富含氨基酸、蛋白质、多糖多肽等营养和药用成分，具有较高的保健和药用价值。但目前的蜜环菌制剂主要以初提混合物为原料，如郭顺星等在“蜜环菌的化学成分及应用研究”(微生物学通报.1996，23(4):239_240)中提出:蜜环菌糖浆以蜜环菌培养液(菌丝连同发酵液)为主要原料，煮沸浓缩制成，主治眩晕头痛，神经衰弱，失眠，美尼尔综合症;蜜环菌浸膏以菌丝体为原料，煮沸、过滤，残渣醇析，醇析物与滤液合并浓缩制成，用于治疗血管性头痛、神经衰弱、冠心病、脑动脉血管硬化等病；蜜环菌片以菌丝体烤干后磨成细粉压片而成，对高胆固醇血症、高甘油三酯血症、降低血压有一定效果。由于蜜环菌制剂成分一般为混合物，缺乏必要的药效物质基础和药效研究，所以其缺乏合理的质量控制标准，难以确保临床用药的有效性、安全性、可持续性。可见，对黄绿蜜环菌的化学成分进行进一步提取和研究非常有必要。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对上述现有技术的不足，提供一种从黄绿蜜环菌中提取抗肿瘤活性组分的方法，该方法采用离线高效液相色谱进行分离纯化，分离方法稳定，重复性高，制备量大，得到的目的组分纯度可达98%以上，且操作简单省时，能满足工业化生产需求。本专利技术所采用的技术方案为:—种从黄绿蜜环菌中提取抗肿瘤活性组分的方法，该方法包括以下步骤:(1)以黄绿蜜环菌子实体为原料，经干燥并磨成粉末状后，用乙酸乙酯以液固比(5_10)mL:lg进行浸泡，然后过滤取上清，得到乙酸乙酯提取液，并浓缩至膏状；(2)使用乙醇体积分数为10-35%的正己烷-乙醇二元混合溶剂溶解步骤(1)得到的膏状乙酸乙酯提取物，得到100-150mg/ mL的上样溶液；(3)对上样溶液进行一维液相色谱分离:采用的色谱柱为Silica正相硅胶色谱柱，采用的流动相为二元混合有机相，其中A相为正己烷、B相为乙醇，进样量为50-150mL/针，流动相流速为550-600mL/min，检测器为紫外检测器，检测波长210-260nm;采用的洗脱方式为B相浓度由0 %至75 %梯度洗脱45-75min，根据紫外吸收光谱收集10_14min洗脱液作为目的组分，减压浓缩至膏状，得到一维液相组分；(4)用乙醇体积分数为2-13 %的乙醇-正己烷二元混合溶剂溶解一维液相组分，溶解至浓度为50-100mg/mL;(5)进行二维液相色谱分离:采用的色谱柱为Silica正相硅胶色谱柱，采用的流动相为二元混合有机相，其中A相为正己烷、B相为乙醇，进样量为500-2000μ!7针，流动相流速为10-30mL/min，检测器为紫外检测器，检测波长210-260nm，采用的洗脱方式为Β相浓度4-8%等度洗脱20-30min，根据紫外吸收光谱收集6-8min洗脱液作为目的组分，旋转蒸发浓缩至干，得到二维液相组分；(6)用乙醇体积分数为2-13 %的乙醇-正己烷二元混合溶剂溶解二维液相组分，溶解至浓度为50-100mg/mL;(7)进行再分离纯化:采用的色谱柱为Silica正相硅胶色谱柱，采用的流动相为二元混合有机相，其中A相为正己烷、B相为乙醇，进样量为300-1500μ?7针，流动相流速为10-30mL/min，检测器为紫外检测器，检测波长210-260nm，采用的洗脱方式为Β相浓度2-3%等度洗脱35-45min，根据紫外吸收光谱收集7.5_12min洗脱液作为目的组分，旋转蒸发浓缩至干，得到目的产物抗肿瘤活性组分。所述步骤(3)中的Silica正相娃胶色谱柱的尺寸为直径150mm、柱长250mm，其中娃球粒径为10-50μπι，使用时柱温为室温或25-40°C。所述步骤(5)、(7)中的Silica正相娃胶色谱柱的尺寸为直径20mm、柱长250mm，其中硅球粒径为10-50μπι，使用时柱温为室温或25-40°C。本专利技术进一步提供上述提取得到的抗肿瘤活性组分在制备抗肝癌药物中的应用。该抗肿瘤活性组分作为有效成分，按常规方法如口服、注射，与药学上的可接受载体或赋形剂，制成适合口服、注射等给药方式的剂型，如:片剂、胶囊、注射剂等。本专利技术原料黄绿蜜环菌化学成分复杂、物质极性比较集中，所以本专利技术先选用乙酸乙酯进行有效组分的粗提，且乙酸乙酯为脂溶性溶剂，与其相似相溶的组分也应该具备进入生物活性细胞所必需的脂溶性特性，从而具有更高的进入细胞参与细胞内作用的可能性。其次在色谱分离的选择上选用离线液相色谱技术进行有效组分的提取，其优势在于液相色谱不仅具有更高的峰容量，而且三维具有不同的选择性。经过一维简化的组分可以在二维、三维上根据不同的选择性实现互补分离，结构相似的化合物可以在二维、三维上达到有效分离，从而提高制备的效率和化合物纯度。本专利技术利用液相色谱制备的方法成功从黄绿蜜环菌中提取分离得到纯度达98%以上的天然小分子单体化合物，该方法工艺简单，时间周期短，试剂耗费量小，制备量大，稳定可控，重复性好，实用性高，适用于大规模工业化生产的需要。现在药理研究表明，黄绿蜜环菌具有多种药理作用和保健作用并被广泛应用于心脑血管疾病、妇科各类疾病的治疗。因此从中分离出具有确切结构并且易于进行化学合成的集抗癌活性为一体的化合物必将为抗癌新药的研发奠定基础。本专利技术得到的目的组分性质稳定，通过细胞在线实时监测的方法观测其在体外的抗肿瘤作用，发现该化合物对肝癌Hep-g2细胞具有抑制作用;该化合物在体外实验抗肿瘤作用明显，具有抗癌药物开发潜力，为抗癌天然药物的开发提供了有力的依据。【附图说明】图1所示的是本专利技术实施例1中的一维高效液相色谱图；图2所示的是本专利技术实施例1中的二维高效液相色谱图；图3所示的是本专利技术实施例1中的三维高效液相色谱图；图4所示的是本专利技术所得目的组分的分析型高效液相色谱图；图5所示的是本专利技术实施例2中的一维高效液相色谱图；图6所示的是本专利技术实施例2中的二维高效液相色谱图；图7所示的是本专利技术实施例2中的三维高效液相色谱图；图8所示是本专利技术所得目的组分对肝癌Hep_G2细胞的抑制作用。【具体实施方式】以下结合实施例对本专利技术作进一步具体描述。应该指出，以下具体说明都是例示性的，旨在对本专利技术提供进一步的说明。除非另有说明，本专利技术使用的所有科学和技术术语具有与本专利技术所属
人员通常理解的相同含义。1、原料、材料:黄绿蜜环菌子实体采摘自青海祁连并经过鉴定;Hep_G2细胞由中国医学科学院血液病医院提供。2、试剂:无水乙醇购自天津市北方天医化学试剂厂；色谱级乙酸乙酯、正己烷购自Honeywell公司；DMS0购自天津康科德科技有限公司；MEM培养基购自Life TechnologiesCorporat1n。3、仪器设备:超微粉碎机购自山东三清不锈钢设备有限公司；台式冷冻离心机购自Thermo公司；恒温鼓风干燥箱购自上海一恒科学仪器有限公司；旋转蒸发仪上海亚容生化仪器厂；si 1 ica硅胶色谱柱购自博纳艾吉尔有限公司；制备型高效液相色谱仪购自江苏汉邦科技有限公司；iCELLig本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种从黄绿蜜环菌中提取抗肿瘤活性组分的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)以黄绿蜜环菌子实体为原料，经干燥并磨成粉末状后，用乙酸乙酯以液固比(5‑10)mL︰1g进行浸泡，然后过滤取上清，得到乙酸乙酯提取液，并浓缩至膏状；(2)使用乙醇体积分数为10‑35％的乙醇‑正己烷二元混合溶剂溶解步骤(1)得到的膏状乙酸乙酯提取物，得到100‑150mg/mL的上样溶液；(3)对上样溶液进行一维液相色谱分离：采用的色谱柱为Silica正相硅胶色谱柱，采用的流动相为二元混合有机相，其中A相为正己烷、B相为乙醇，进样量为50‑150mL/针，流动相流速为550‑600mL/min，检测器为紫外检测器，检测波长210‑260nm；采用的洗脱方式为B相浓度由0％至75％梯度洗脱，根据紫外吸收光谱收集10‑14min洗脱液，减压浓缩至膏状，得到一维液相组分；(4)用乙醇体积分数为2‑13％的乙醇‑正己烷二元混合溶剂溶解一维液相组分，溶解至浓度为50‑100mg/mL；(5)进行二维液相色谱分离：采用的色谱柱为Silica正相硅胶色谱柱，采用的流动相为二元混合有机相，其中A相为正己烷、B相为乙醇，进样量为500‑2000μL/针，流动相流速为10‑30mL/min，检测器为紫外检测器，检测波长210‑260nm，采用的洗脱方式为B相浓度4‑8％等度洗脱，根据紫外吸收光谱收集6‑8min洗脱液，旋转蒸发浓缩至干，得到二维液相组分；(6)用乙醇体积分数为2‑13％的乙醇‑正己烷二元混合溶剂溶解二维液相组分，溶解至浓度为50‑100mg/mL；(7)进行再分离纯化：采用的色谱柱为Silica正相硅胶色谱柱，采用的流动相为二元混合有机相，其中A相为正己烷、B相为乙醇，进样量为300‑1500μL/针，流动相流速为10‑30mL/min，检测器为紫外检测器，检测波长210‑260nm，采用的洗脱方式为B相浓度2‑3％等度洗脱，根据紫外吸收光谱收集7.5‑12min洗脱液，旋转蒸发浓缩至干，得到本专利技术抗肿瘤活性组分。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张耀洲，王欢欢，杜思邈，盖其静，
申请(专利权)人：正源堂天津生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12
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