本发明专利技术涉及一株牛支原体及应用。其步骤为通过病原分离培养、动物回归试验和16S rRNA基因序列测定，确定病原为牛支原体，命名为牛支原体MbovFJ1201株，保藏编号为CCTCC NO：M2015772。将此菌接种到培养基扩大培养，收获培养物，将培养物灭活，灭活后按1:1（V/V）比例加入ISA-206佐剂混合得到灭活疫苗。本发明专利技术的疫苗针对性强，免疫保护效果好，能显著地减轻因感染牛支原体而引起的肺脏病变，提高平均日增重，能达到预防和控制牛支原体相关疾病的良好效果。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及牛用疫苗领域，具体说是。
技术介绍
牛支原体相关疾病是危害养牛业的重要疫病。牛支原体感染能引起牛的肺炎、关 节炎、乳房炎和结膜炎等疾病。自1961年美国首次报道分离到牛支原体以来，在不同国家都 有暴发流行，给养牛业造成了严重的经济损失。美国和欧洲因牛支原体感染所引起的犊牛 肺炎所致的损失就达数亿美元之巨。石磊等于2008年首次报道我国牛支原体的流行，此后 的调查研究表明牛支原体在我国的牛群中普遍存在。牛支原体不仅导致很高的发病率和死 亡率，而且经治疗后症状缓解的患牛一般发育迟缓，甚至成为废牛。 由于支原体的细胞结构介于病毒和细菌之间，且支原体的分离培养难度很大。因 此，对其致病机理以及预防控制手段的研究还较不完善。目前，一般使用常规抗菌药物对牛 支原体相关疾病进行处理，但作用甚微。因此，亟需一种免疫效果确实的疫苗对该病进行预 防和控制。
技术实现思路
本专利技术提供。 利用从病牛肺脏中分离得到的牛支原体(Mycoplasma bovis)MbovFJl201株为种 子，此菌株于2015年12月23日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址为武汉大学，保藏编号 为CCTCC N0:M2015772。 本专利技术的目的在于提供一种以ISA-206为佐剂的牛支原体灭活疫苗，用于牛支原 体相关疾病的预防和控制。 本专利技术的目的通过如下方法实现。 牛支原体灭活疫苗中含牛支原体菌量为108ccu/mL、50wt.% ISA-206佐剂。 由以下步骤制备而成： 1) 抗原液的制备； 2) 疫苗的配制，取灭活菌液与ISA-206佐剂混合，分装后密封保存。所述抗原液的制备由以下步骤完成:将牛支原体MbovFJ1201株按3% V/V接种到培 养基扩大培养，培养3-5天，收获培养物，测定菌株浓度并调整为2 X 108ccu/mL;加入甲醛， 使其终浓度为0.2%，置4°C灭活72小时制成灭活菌液。 疫苗的配制是将灭活菌液和ISA-206佐剂按体积比1:1混合制备而成。 步骤1)所述培养条件为为37°C、5% C02培养3~5天，控制培养时间，保证灭活疫苗 具有适量的抗原量。 步骤2)所述培养基为含酚红的PPL0培养基。本专利技术所述牛支原体灭活疫苗，30日龄犊牛颈部三角区肌肉注射2mL疫苗，60日龄 以2mL剂量加强免疫一次，免疫后保护力可达到80%以上，免疫保护期至少可持续5个月，其 免疫保护效果确实，制备工艺简单，具有良好的应用前景。【具体实施方式】 以下结合实施例对本专利技术作进一步详细说明。 实施例1 牛支原体的分离和鉴定 将临床病料进行细菌分离培养、动物回归试验和16S rRNA基因测序，分离到三株致牛 肺炎的牛支原体（Mycoplasma bovis)，分别命名为Mycoplasma bovis FJ1201 (MbovFJ1201)、Mycoplasma bovis FJ1301(MbovFJ1301)和Mycoplasma bovis FJ1501 (MbovFJ1501)<a6S rRNA基因序列比对结果表明，MbovFJ1201、MbovFJ1301 和MbovFJ1501 的 序列相似性为100%，说明这三株分离株为同一菌株。 1材料和方法 1.1材料 1.1.1病料:来自于2012-2015年在福建省福州市、长乐市、厦门市、南平市和三明市多 个养牛场，临床病料均为肺炎重症病牛或病死牛的肺脏组织，主要采集坏死灶及其周围的 健康组织。采集的病料及时进行支原体的分离培养。 1.1.2支原体培养基:PPL0液体培养基，含PPL0肉汤粉、酵母粉、丙酮酸钠 MEM、马 血清、青霉素和l%(w/v)酚红;PPL0固体培养基，含1.5%(w/v)琼脂粉的PPL0液体培养基。培 养基于115°C灭菌15min后，于4°C保存备用。 1.1.3 16S rRNA引物:采用16S rRNA通用引物，委托上海生物工程技术有限公司 合成。引物序列如下： 16S rRNA上游引物：5 ' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ' 16S rRNA下游引物：5 ' -ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3 ' 1.1.4试验动物：2月龄健康的荷斯坦犊牛和闽南黄牛，试验前经牛支原体间接血凝 实验检测为牛支原体抗体阴性。 1.2 方法 1.2.1支原体的分离培养 无菌条件下将采集的病肺组织切成小块。将小块组织的切面涂于PPL0固体培养基表 面，同时将小块组织接种到PPL0液体培养基中，置于37°C 5% C02培养箱中培养。3~5 d后观 察固体培养基上菌落的形态，支原体的典型形态为"煎荷包蛋样"。此外，液体培养基由红色 变为黄色，但保持清亮，对照组的培养基为红色。 挑取PPL0固体培养基上具有"煎荷包蛋样"典型特征的菌落，接种到不含青霉素的 PPL0液体培养基中，连续传3代。将第3代培养物适当稀释后涂布于PPL0固体培养基，培养3~ 5 d，培养基上的菌落依然表现为典型的"煎荷包蛋样"形态。 1.2.2动物回归试验 试验牛为2月龄健康的荷斯坦犊牛和闽南黄牛，其中荷斯坦公犊牛4头、母犊牛4头，闽 南黄牛公犊牛4头、母犊牛4头。试验动物分为两组，对照组8头，试验组8头。两组试验动物各 包括随机分组的荷斯坦公犊牛2头、母犊牛2头，闽南黄牛公犊牛2头、母犊牛2头。试验组动 物通过喉气管接种3mL 72h的支原体液体培养物(MbovFJ1201)，对照组动物通过喉气管接 种3mL灭菌的PPLO液体培养基。试验期为15d，每天观察试验动物的临床表现，测量体温，如 试验动物死亡则立即进行剖杀，观察呼吸道病变病采集病料。于15d试验结束时，剖杀所有 试验组动物并剖杀2头对照组动物。 1.2.3支原体的鉴定 1.2.3.1取200yL支原体液体培养物，用碱裂解法提取支原体基因组，以此为模板扩增 16S rRNA基因。PCR反应体系为25yL，其中 2 X Taq MiX(Takara) 12 · 5yL，上、下游引物（10μ mol/L)各lyL，支原体基因组模板1.5yL，去离子水补齐至25μΙ^ΡΟ?反应程序为:95°C预变性 5min 后，95°C 变性 lmin，42°C 退火 30s，72°C 延伸 1 · 5min，30 个循环后，72°C 延伸 lOmin JCR 产 物在1%琼脂糖上电泳，目的条带大小约1500bP<3PCR产物回收后，委托上海生物过程技术服 务有限公司进行基因序列测定。 2 结果 2.1支原体的分离培养 将分离自小块病变肺脏组织中呈"煎荷包蛋样"形态的菌落接种于不含青霉素的液体 PPL0培养基，连续传代3次后，再接种于固体PPL0培当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株牛支原体，其特征在于：所述牛支原体为牛支原体MbovFJ1201，已于2015年12月23日于中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为：CCTCC NO：M2015772。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张德明，林燕花，王锦祥，李金凤，车勇良，张梦青，
申请(专利权)人：福清市默克兽医院，
类型：发明
国别省市：福建;35
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