本发明专利技术提出了一种钙网蛋白(Calreticulin,CALR)基因第9外显子L367fs*46(c.1179-1230del)、K385fs*4(c.1234-1235insTTGTC)缺失、插入突变的检测方法，依据CALR基因第9外显子的缺失、插入突变区域设计通用扩增引物，依据所述扩增片段设计特异检测荧光探针，对待测样品进行实时荧光定量PCR(real time PCR)，通过单管多重反应鉴定CALR基因缺失、插入突变。本发明专利技术还提出了所述通用扩增引物及特异探测荧光探针在制备用于检测骨髓增殖性肿瘤的试剂中的应用。本发明专利技术还提出了用于检测骨髓增殖性肿瘤的试剂盒。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医学检测
，涉及一种f丐网蛋白（Calreticulin，CARL)基 因缺失、插入突变的检测方法，具体涉及一种基于CARL基因9号外显子(exon 9)L367fs*46 (c.ll79-1230del)、K385fs*4(c.l234-1235insTTGTC)缺失、插入突变的核酸实时荧光 PCR 检测方法。
技术介绍
骨髓增殖性肿瘤(Myeloproliferative neoplasms，MPN)是一组以造血干细胞，粒 细胞系统，红细胞系统、巨核细胞系统和肥大细胞过度增殖为特征的肿瘤疾病。一般的，MPN 包括了：慢性髓性白血病（Chronic myelogenous leukemia，CML)，真性红细胞增多症 (Polycythemia vera，PV)，原发性血小板增多症（Essential thrombocythemia，ET)，原发 性骨髓纤维化（P r i m a r y m y e 1 〇 f i b r 〇 s i s，P M F )，慢性中性粒细胞白血病 (chronicneutrophi 1 icleukemia，CNL)，慢性嗜酸性粒细胞白血病非特质型（Chronic eosiophilie leukemia,CEL)，肥大细胞增多症(Mastocytosis)，和骨髓增殖性肿瘤未分类 型(MPN-U)八个类型。基于Dameshek最初对骨髓增殖性疾病的归纳，PMF、PV、ET与CML合称为 经典型MPN;而其余的在流行病学特点、临床表现及实验室特征均有别于上述四种的则被归 类为"非经典MPN'MPN的患者由于血细胞的过度增殖，会导致血液淤滞、粘稠度增加，而引 发各种心脑血管疾病。目前MPN的发病率正逐年升高，而且发病年龄有逐步年轻化趋势，因 此提高对此类疾病的诊断、治疗水平势在必行。 各个MPN在临床特征和远期预后都存在差异，治疗的目标和手段也有所不同；所以 有必要在诊断时能够加以区分，以达到精准医疗的目的。常规的MPN检测诊断指标和方法包 括血细胞计数，骨髓穿刺检测，环钻活检，动脉血氧饱和度，碳氧血红蛋白水平，嗜中性粒细 胞碱性磷酸酶水平，血清尿酸，维生素 B12水平。虽然在一般情况下这些指标可以在一定程 度上指示MPN;但值得注意的是，对于其他的因机体自身应激性的骨髓增殖而导致的上述指 标升高则无法与肿瘤性增生区分开，容易形成对MPN误诊。更重要的是，上述方法对于"非典 型MPN"则无法区分和诊断。 在核酸水平检测诊断MPN是近年来一直发展的新指标。其中CML存在有100%特异 性的BCR/ABL基因融合。鉴定后，可针对性的靶向使用受体酪氨酸激酶抑制剂(TKI)。除CML 之外其余各类型MPN可统称为BCR/ABL阴性MPN。对于BCR/ABL阴性的MPN，较为经典的分为3 类:PV，ET和PMF。因其临床表现相似，需要排除复杂的继发因素，形态学诊断存在诸多难题 和不足，而且易受医生主观因素影响。所以这类疾病的明确分子标志基因具有重要临床意 义。目前有数个标记指示基因（Bio-marker)被报道。研究发现约81 %~99%的PV、约41 %~ 72%的ET和39%~57%的PMF患者带有铬氨酸蛋白激酶2(Janus Kinase 2，JAK2)JAK2-V617F突变，随后又证实约2%的JAK2-V617F突变PV患者有JAK2第12外显子异常（突变、缺失 或插入）。因此，在2008年WHO MPN诊断标准中将存在JAK2-V617F突变或其他功能类似的突 变(例如JAK2第12外显子突变)列为PV诊断主要标准之一。对于JAK2-V617F阴性的ET和PMF 则可以通过鉴定血小板生成素受体(Thrombopoietin Receptor)突变区（MPL515)，MPL突变 检测对于JAK2-V617F突变阴性的ET和PMF的诊断和治疗是十分必要的，所以MPL515突变检 测也已经列入了 WHO制定的诊断特发性血小板增多症和原发性骨髓纤维化的指标之一。 值得注意的是，JAK2和MPL阴性约40%的原发性血小板增多症(ET)或原发性骨髓 纤维化(PMF)仍然缺乏明确的诊断分子标记。2013年，1'11〇^丨611博士等两个研究组从￥65数 据分析中发现，JAK2和MPL野生型的ET或PMF患者中存在CALR基因重复性的插入或缺失。具 体为CALR9号外显子中52bp缺失的I型突变或一个5bp的插入的II型突变。与JAK2突变者相 比，CALR突变的ET和PMF患者往往白细胞计数更低，血小板计数更高。无论ET或PMF，CALR突 变者较JAK2突变者具有更好的总生存，而且具有CALR突变的ET患者较JAK2突变者具有较低 的血栓发生率。综上，CALR基因突变主要见于JAK2和MPL突变阴性的MPN，对于CALR突变的检 测有望进一步提高对MPN的诊断水平，可以为MPN的个体化治疗及最终的精准治疗提供重要 依据。 目前基于血清样本的肿瘤核酸诊断技术主要包括:PCR-RFLP(PCR限制性片段多态 性），SSCP(单链构象多态性），DGGE(变性梯度凝胶），AFLP(扩增片段长度多态性），基因测 序，基因芯片，多重PCR，定量PCR等。定量PCR技术因简单、快捷、准确及灵敏度高被广泛发展 和应用。在检测技术上主要包括了DNA结合染料（SYBR Green/EvaGreen)，水解探针技术 (Taqman probe)，杂交探针(Hybridization probe)技术。本专利技术首次提出一种新的多重 Taqman探针法(Multiplex Taqman)通过一次性检测快速获得准确检测结果。
技术实现思路
本专利技术提出了一种CALR基因的PCR检测方法，所述方法能够同时检测CALR基因的 野生型、插入型、缺失型中任意的一种或几种的组合。依据CALR基因9号外显子的缺失、插入 突变区域设计以下通用扩增引物。其中，所述CALR基因9号外显子的缺失区域是L367fs*46 (c. 1 179-1230del)，所述CALR基因9号外显子的插入区域是K385fs*4(c. 12 34-1235insTTGTC)〇 上游引物 下游引物5 ' -3 ' 序列：TCTTCCTCCTTGTCCTCCTCA。 当特异检测荧光探针只有一种时，本专利技术所述方法能准确地检测其为野生型、插 入突变、缺失突变三种中的哪一种基因型；即， 当特异检测荧光探针为： 野生型(WT) 5 ' -3 '序列：CCTCCTCCTCCGTCTCCTGTTCCTCCT时，本专利技术的方法能准确 地检测CALR基因为野生型。 当特异检测荧光探针为： 缺失突变(DEL)5 ' -3 '序列：TTGTCCTGCTCCTCGTCTCCTGTTCCT时，本专利技术的方法能准 确地检测CALR基因为缺失突变(缺失型）。 当特异检测荧光探针为： 插入突变（INS)5 ' -3 ' 序列：TCTCCTCCTCCTCCGTCTCCTGTTAACAG 时，本专利技术的方法能 准确地检测CALR基因为插入突变(插入型）。 当特异检测荧光探针含有两种时，本专利技术所述方法能准确地检测出CALR基因分别 为野生型和缺失突本文档来自技高网...
【技术保护点】
CALR基因缺失、插入突变的检测方法，其特征在于，所述方法为，依据CALR基因9号外显子的L367fs*46(c.1179‑1230del)、K385fs*4(c.1234‑1235insTTGTC)缺失、插入突变区域设计通用扩增引物，依据所述扩增片段设计特异检测荧光探针，对待测样品进行实时荧光定量PCR，通过单管多重反应鉴定CALR基因的野生型、缺失型和插入型中任意的一种或几种的组合。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王荣芳，关明，钱震斌，施长根，吴之源，陈昊，
申请(专利权)人：德赛诊断系统上海有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31
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