本发明专利技术公开了一种利用双重荧光PCR检测A型H5N6亚型禽流感病毒的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括：扩增H5和N6基因的PCR引物及探针，其核苷酸序列如Seq ID No：1-6所示，探针5’端标记有荧光报告基团，3端标记有荧光猝灭基团；RT-PCR反应液、酶混合液、阳性标准品、阴性标准品。本发明专利技术还公开了利用该试剂盒进行检测的方法，包括：提取样品核酸、配置反应体系、通过荧光定量PCR进行扩增、结果判读等步骤.结果显示，本发明专利技术提供的检测试剂盒能够快速检测A型H5N6型禽流感病毒，具有操作简单、灵敏度高，特异性好等优点，能为A型H5N6亚型禽流感病毒的监测和临床诊断提供一种高效的检测手段。
【技术实现步骤摘要】
[00011本专利技术涉及生物检测
，具体涉及一种A型H5N6亚型禽流感病毒双通道实 时荧光PCR检测试剂盒和检测方法。
技术介绍
流感病毒是流行性感冒的病原体，属于正粘病毒科，为RNA病毒，根据流感病毒核 蛋白（Nucleoprotein，NP)和基质1蛋白（Matrix protein 1，M1)抗原性的不同，流感病毒可 分为A、B、C三型，其中A型流感病毒是正粘病毒科的唯一属，根据流感病毒表面血凝素 (hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(neuraminidase，NA)抗原性的不同，A型流感病毒可分 为18个HA亚型（H1-H18)和11个NA亚型（N1-N11)，H5N1亚型禽流感病毒(Avian inf luenza virus，AIV)表示一个禽流感病毒具有H5型HA蛋白和N1型ΝΑ蛋白。因此，在理论上，根据目前 已知的18个ΗΑ和11个ΝΑ亚型可以组合形成198个亚型流感病毒.人感染Α型流感病毒通常局 限于3种HA亚型（H1，H2和H3)和2种NA亚型（N1和N2)，而家禽和野生鸟类通常作为其他亚型 流感病毒的天然宿主。许多跨物种传播的禽流感病毒已经报道，如H5N1，H5N2，H9N2，H7N7， !17呢，!17似，!11(^7，!17册和!11(^8，尤其是!15附和!17册亚型禽流感病毒疫情造成了巨大的经 济损失和人感染死亡病例。 2014年2月，一种新型的H5N6亚型重配禽流感病毒造成人类感染，截止2015年7月， 全球共报告5例人感染病例，全部病例发生在中国大陆，另外在老挝、越南及中国大陆的禽 及禽类市场环境中已检出H5N6亚型禽流感病毒，表明人感染H5N6亚型禽流感疫情形势不容 乐观。为了有效地控制人感染H5N6亚型禽流感疫情，早期、快速、特异和敏感的检测方法研 究成为当务之急。目前针对H5N6亚型禽流感病毒的检测主要依赖病毒培养、核酸检测和基 因测序等方法，其中实时荧光PCR方法因具有快速、特异、敏感的特点，已成为各大研究机构 和生物试剂公司优先研究开发的重点方向. 随着分子生物学的快速发展，实时荧光PCR技术在流感分子诊断领域发展最快。 2004年Jurgen A.Richt等利用real-time RT-PCR技术进行了北美猪流感病毒的型别和亚 型的分子诊断，该体系每次只能进行一个型别或亚型的诊断.2006年multiplex PCR技术 被用于呼吸道病毒的分子诊断.2007年有人利用2套multiplex PCR对12种呼吸道病毒进行 了分子诊断，但这两种方法都靠凝胶电泳进行结果分析，且自身存在灵敏度差、易交叉污染 等不足。2007年real-time PCR被用于同时进行人禽流感病毒H5N1亚型的分子诊断.2008年 多重real-time PCR开始被用于常见呼吸道病毒的分子诊断.2009年多管多重荧光定量PCR 被用于检测新甲型H1N1流感病毒和季节性流感病毒.2010年单管多重荧光定量PCR开始被 用于流感病毒亚型分型.但因为流感病毒的多变性，目前尚没有针对新近发现的A型H5N6流 感病毒的单管多重荧光定量PCR试剂盒和诊断方法的报道.
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种快速、特异性强、灵敏度高的A型H5N6亚型禽流感 病毒双通道实时荧光PCR检测试剂盒，可用于H5N6亚型禽流感病毒的监测和临床诊断。 本专利技术所述检测试剂盒具体包括以下组分： (l)RT-PCR反应液：含有50mM MgS〇4、0.4mM dNTPs; (2)引物和探针混合液:包含H5及N6特异性引物、探针，其中H5-F和N6-F引物浓度 均为20yM，H5-R和N6-R引物浓度均为40μΜ，Η5和N6探针浓度为20μΜ;扩增特异性引物的序列 如下： Η5上游引物H5-F:5-ATTGCTCCAGAATATGCATA-3(Seq ID No:l); H5下游引物H5-R:5-AGARTTTATCGCCCCTATTG-3(Seq ID No:2); H5特异性探针H5-probe: 5-荧光报告基团-CAAAATWGTCAAGAAAGGGG-荧光猝灭基 团-3(Seq ID No:5); N6上游引物N6-F:5-CTAGGGTCGARTGCATAGGATG-3(Seq ID No:3); N6下游引物N6-R:5-TACCACACYACTGCCGATGC-3(Seq ID No:4); N6特异性探针N6-probe:5-荧光报告基团-AAGCACGTCATGCCAYGATG-荧光猝灭基 团-3(Seq ID No:6); (3)酶混合液:含有逆转录酶、Taq酶； (4)阳性标准品为含H5N6亚型禽流感病毒特异性HA和NA基因片段DNA浓度分别为 3.6 ng/yL和3.3ng/yL的质粒混合物； (5)阴性标准品为ddH2〇。 上述A型H5N6亚型禽流感病毒HA和ΝΑ基因的双通道核酸检测试剂盒扩增反应液每 管20.0 yL，最优组成为:RT-PCR反应液16. OyL、引物和探针混合液3. OyL、酶混合液1. OyL. 本专利技术的双通道荧光PCR检测用引物具体包括两对引物及其各自对应的探针，分 别扩增、检测H5基因和N6基因. 本专利技术的探针一端标记有荧光报告基团，探针另一端标记有荧光猝灭基团，荧光 报告基团可以为常见的所述的荧光报告基团包括:MAR、JUP、URA、NEP、PLU、FAM、HEX、JOE、 NED、TET、R0X或CY5;荧光猝灭基团包括:了六11^、8即1、8即2，两条探针的荧光报告基团不相 同即可.优选的，H5探针标记的焚光报告基团为FAM焚光基团，N6探针标记的焚光报告基团 为Hex，所述的荧光猝灭基团均为BHQ1. 本专利技术的酶混合物，由逆转录酶和Taq酶组成，所述的逆转录酶为鼠白血病病毒逆 转录酶，Taq酶为常见的耐热Taq聚合酶。两种酶的浓度分别为2IU/yL和2IU/yL。 本专利技术的反应体系中，所述的RT-PCR反应液、引物和探针混合液、酶混合液可以分 开单独保存，也可以混合在一起，优选混合在一起保存.本专利技术所述的阳性标准品，可以为含有H5基因和N6基因的DNA片段，该DNA片段可 以为PCR扩增后产物、质粒、人工合成基因. 本专利技术样本核酸的提取，可参考现有病毒RNA提取技术，优选试剂盒提取法。 本专利技术试剂盒的PCR扩增程序为:①50°C30min，②95°C10min，③95°C15sec，④55 °C45sec，其中③-④循环40次，荧光收集在步骤④。 本专利技术的另一目的在于提供一种利用本试剂盒进行检测的方法，包括以下步骤： (1)病毒RNA的提取； (2)试剂配置:在标明编号的PCR反应管中加入扩增反应液16.OyL、引物和探针混 合液3. OyL、待检模板5. OyL和酶混合液1. OyL;阳性标准品反应管和阴性标准品反应管中各 加入5.0μΙν^准品； (3)PCR扩增：将上述PCR反应管混匀、离心后置于荧光定量PCR仪上，设置扩增程 序：①50°C30min，②95°C10min，③95°C15sec，④55°C45sec，其中③-④循环40次，④收集 信号. (4)PCR反应结束后，检测PCR反应体系本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种A型H5N6亚型禽流感病毒双通道实时荧光PCR检测试剂盒，主要由以下组分组成：(1)RT‑PCR反应液：含有50mM MgSO4、0.4mM dNTPs；(2)引物和探针混合液：含扩增H5基因的引物对1、N6基因的特异性引物对2及分别对应的特异性探针；所述引物对1为扩增H5基因的引物对，其上游引物H5‑F为Seq ID No.1所示序列，下游引物H5‑R为Seq ID No.2所示序列：Seq ID No.1：5‑ATTGCTCCAGAATATGCATA‑3；Seq ID No.2：5‑AGARTTTATCGCCCCTATTG‑3；所述引物对2为扩增N6基因的引物对，其上游引物N6‑F为Seq ID No.3所示序列，下游引物N6‑R为Seq ID No.4所示序列：Seq ID No.3：5‑GGGTCGARTGCAYAGGATG‑3；Seq ID No.4：5‑TACCACACYACTRCCGATG‑3；所述H5基因对应的探针H5‑probe为Seq ID No.5所示的序列：Seq ID No.5：5‑CAAAATWGTCAAGAAAGGGG‑3；所述N6基因对应的探针N6‑probe为Seq ID No.6所示的序列：Seq ID No.6：5‑AAGCACGYCATGCCAYGATG‑3；(3)酶混合液：逆转录酶、Taq酶；(4)含有H5N6亚型禽流感病毒特异性HA和NA基因片段DNA的阳性标准品。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张如胜，陈发明，孙边成，欧新华，
申请(专利权)人：长沙市疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：湖南;43
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