本发明专利技术提供了一种分层包装带指示剂的直接实时定量荧光PCR方法，将热启动DNA聚合酶和PCR扩增反应液各自分层包装在PCR扩增管内，使用时加入核酸裂解液和待测样品，进行实时定量荧光PCR。利用本发明专利技术可检测出低至20IU/ml的病毒量，优选的检测范围为30～2×109IU/ml。检测结果不受操作人员专业水平和实验室实验条件的限制，具有操作简便、快速的优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学领域，特别涉及一种分层包装带指示剂的直接实时定量荧 光PCR方法。
技术介绍
聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction，PCR)是一种根据生物体内DNA复 制性质而设计的体外快速扩增特定DNA序列的技术。PCR反应体系主要由核酸引物、4种 dNTP、DNA聚合酶、模板DNA和PCR反应缓冲液体系组成。自美国Cetus公司人类遗传室Kary Mullis及其同事于1985年专利技术聚合酶链式反应(PCR)以来，PCR技术及其衍生技术就被快速 开发出来，并在多种核酸检测中得到了广泛的运用。尤其是病毒或其他病原体的检测，当知 道待检病原某一特定基因片段时，即可利用特异性的引物对样品中微量的目标DNA进行PCR 扩增，使其达到检测量，通过适当的检测手段进行检测，即可确定病原体的存在与否。 实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用DNA扩增过程中 荧光信号的积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方 法。与普通的PCR相比，实时荧光定量PCR技术具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准 确、速度快、全封闭反应等优点，实现了PCR的定量分析。 目前，无论临床实验室检测还是疫情处理，传染病病原的核酸荧光PCR检测技术， 均需经过核酸提取或纯化过程，该过程需要专门的实验室环境和相应设备，实验操作人员 需经专业培训；另外，这样的操作增加了实验操作步骤，并延长了检测时间，增加了污染的 几率。同时，DNA聚合酶与PCR反应试剂的混合接触，也会导致其活性的降低，从而降低实时 荧光定量PCR的敏感性。因此，需要找到一种试剂稳定性好、操作简便、定量准确的实时定量荧光PCR方法。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是针对实时定量荧光PCR过程中核酸提取操作复杂，容 易产生污染，且PCR灵敏度低的缺点，提供了一种试剂稳定性好、操作简便、定量准确的直接 实时定量荧光PCR方法。为了解决上述技术问题，本专利技术提供的技术方案为： -种分层包装带指示剂的直接实时定量荧光PCR方法，将热启动DNA聚合酶和PCR 扩增反应液各自分层包装在PCR扩增管内，使用时加入核酸裂解液和待测样品，进行实时定 量荧光PCR。本专利技术技术方案的具体实施步骤为： 1)用熔点为50°C~55°C的石蜡油混合物包被热启动TaqDNA聚合酶，并置于PCR扩 增管管底； 2)混合引物、探针、TriS碱、氯化镁、氯化钾、石绿和dNTP，制得焚光PCR扩增试剂于 石蜡油混合物上层； 3)用熔点为40°C~45°C的石蜡油封闭所述荧光PCR扩增试剂于步骤1)的PCR扩增 管内； 4)石蜡油冷凝后，加入核酸裂解试剂和待测样品； 5)检测样品。在本专利技术的技术方案中，专利技术人采用分层包装的方法将热启动DNA聚合酶和PCR扩 增反应液分别用石蜡油混合物包被，使二者彼此分开而不混合，以此保证聚合酶的活性，防 止聚合酶因直接与PCR扩增反应液混合而导致的活性降低。作为优选，所述热启动DNA聚合酶为TaqDNA聚合酶。 作为优选，所述PCR扩增反应液包括引物、探针、Tris碱、氯化镁、氯化钾和dNTP。作为优选，在本专利技术的一个实施方式中，专利技术人利用石蜡油混合物对所述热启动 DNA聚合酶和PCR扩增反应液进行分层包装。作为优选，所述石蜡油混合物包括石蜡油和树 月旨。更优选地，所述石蜡油为优质石蜡油，所述树脂为安息香。作为优选，在本专利技术的一个实施方式中，所述石蜡油混合物的熔点不低于40°C。同 时，调节石蜡油和树脂的混合比例将石蜡油混合物配制成熔点为50°C~55°C和40°C~45°C 的石蜡油混合物。所述热启动DNA聚合酶通过熔点为50°C~55°C的石蜡油混合物被包装在 PCR扩增管底部，所述PCR扩增反应液通过熔点为40°C~45°C的石蜡油混合物被包装在热启 动DNA聚合酶的上部。将热启动DNA聚合酶和PCR扩增反应液分别用不同熔点的石蜡油混合 物包被，可以使PCR反应试剂在加热时首先释放并与已裂解好的样品充分混合，且此时不会 影响聚合酶的活性，防止聚合酶因直接与PCR扩增反应液混合而导致的活性降低。待加热至 72°C时，聚合酶充分释放，并与液体充分混合，以保证后续实验的顺利进行。 为了便于观察石蜡油的分层包装的效果，作为优选，在本专利技术的一个实施方式中， 所述PCR扩增反应液中含有指示剂。更优选地，所述指示剂选自溴酚蓝、石绿、甲基红、甲基 橙、罗丹名、溴甲酚绿、品红、二甲酚橙、二苯胺或刚果红中的一种。 同时作为优选，在本专利技术的一个实施方式中，所述核酸裂解液中也含有指示剂，且 PCR扩增反应液中的指示剂与核酸裂解液中的指示剂不同。这样不仅能够保证石蜡油混合 物的分层包装效果，同时也可保证样品加入的准确性，防止多加、错加、漏加。更优选地，在本专利技术的另一个实施方式中，所述指示剂的加入量低于O.Olwt%。在本专利技术中，所述热启动DNA聚合酶的用量和PCR扩增反应液中各个组分的比例可 以根据需要设置。作为优选，在本专利技术的一个实施方式中，所述热启动DNA聚合酶浓度为2.5 ~3.5U/yL;所述PCR扩增反应液中包含浓度为30~50nmolAxL的上下游引物和10~30nmol/ yL的探针、10 ~30nmolAiL的Tris碱、10 ~30mmolAiL氯化镁、100 ~200mmolAiL氯化钾、150 ~250umolAiL的dNTP和不多于O.OOlwt%的石绿指示剂。在本专利技术中，所述PCR扩增反应液的包装方法为:将20~30yL所述PCR扩增反应液 加入到包装好的热启动DNA聚合酶的上部，加入15~25yL熔点为40~45°C的石蜡油混合物， 来封闭PCR扩增反应液。在所述PCR扩增反应液包装完成后，在其上方加入核酸裂解液。得到的含有热启动 DNA聚合酶、PCR扩增反应液和核酸裂解液的PCR扩增管可立即使用也可封装后冷藏保存。作为优选，在本专利技术的一个实施方式中，所述核酸裂解液由0.2~0.4N氢氧化钠、 0.3~0.6M氯化钾、0.01~0·05%Ν-月桂酰肌氨酸钠、5mMEDTA、0.3~0.6MTris-HCL和1~ 2%曲通X-100组成。更优选地，在本专利技术的另一个实施方式中，所述核酸裂解液由0.3N氢氧化钠、 0.45M氯化钾、0.03%N-月桂酰肌氨酸钠、0.45MTris-HCL、5mMEDTA和1%曲通X-100组成。本专利技术中所述核酸裂解液可根据需要任意设置。作为优选，在本专利技术的一个实施 方式中，所述核酸裂解液的加入量为15~25yL，更优选地为20yL。 作为优选，在本专利技术的一个实施方式中，在加入核酸裂解液和待测样品后对所述 PCR扩增管37°C加热5min，然后在72°C条件下加热30s，500rpm离心后进行实时定量荧光 PCR〇更具体地，利用本专利技术的直接实时荧光定量PCR的方法进行PCR定量检测，包括如 下步骤： 1)将15~25yL待测样本加入到含有热启动DNA聚合酶、PCR扩增反应液和核酸裂解 液的PCR扩增管中，轻轻摇匀； 2)将上述PCR扩增管放置在具有制冷功能的干热器上运行37°C，5min; 72°C，30s， 然后将管内分层试剂颠倒混匀本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种分层包装带指示剂的直接实时定量荧光PCR方法，其特征在于，将热启动DNA聚合酶和PCR扩增反应液各自分层包装在PCR扩增管内，使用时加入核酸裂解液和待测样品，进行实时定量荧光PCR。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王海滨，王棽，周其玲，冯小霞，
申请(专利权)人：北京纳捷诊断试剂有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
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