一种离体培养用水稻花药快捷分离方法技术

本发明专利技术公开了一种离体培养用水稻花药快捷分离方法，所述分离方法的步骤如下：（1）取穗及预处理；（2）对预处理后的稻穗进行灭菌；（3）将稻穗进行机械分割，切碎的稻穗倒入离心管中密封后置于摇床上震荡；（4）将离心管放入高速冷冻离心机中，20℃条件下9000-10000rpm离心获得离体花药；（5）对离体花药进行接种培养。本发明专利技术通过对水稻花药采取机械切割的方式进行破碎，然后采用离心力对碎片进行分离，提取到了纯净的水稻花药，并通过优化离心介质和采用无菌操作，获取到了活力旺盛的水稻花药，并将分离获取的水稻花药进一步花培验证成功，该水稻花药快捷分离方法提高了花培操作量的同时提升了花培工作效率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术设及，属于农业科学

技术介绍
水稻花药培养是指用植物组织培养技术，把发育到一定阶段的花药，接种在人工 培养基上离体培养，W改变花药内花粉粒的发育程序，诱导其分化，并连续进行有丝分裂， 形成细胞团，进而形成一团无分化的薄壁组织--愈伤组织，随后使愈伤组织分化成完整的 水稻植株。花培植株经过人工加倍或自然加倍产生纯合的二倍体植株，通过常规系统选育 方法，选出综合性状优异的纯合稳定株系（品系），再经过进一步的品种比较、区域试验和生 产示范育成新的品种，运种花培技术与常规育种相结合的方法就是花培育种。 水稻花药培养是当今生物技术育种中较为成熟、实用、快速、有效的育种新技术。 水稻花药培养育种主要特点表现为缩短育种周期，提高选择效率，加速有效性状转移等。花 药培养育种已与常规杂交育种、远缘杂交育种、诱变育种W及转基因技术相结合，发展形成 了一套育种技术体系。花培育种是水稻育种多、快、好、省的新途径，在传统农业向高技术农 业的转化中发挥着纽带作用。 1968年日本新关和大野通过花药离体培养获得水稻花培植株，掲开了人类利用花 药创造水稻新种质的序幕。水稻花培育种具有缩短育种年限、扩大变异范围、提高选择效率 等优势，近几十年来发展很快，在水稻育种中已被广泛应用。花培育种是近代生物技术的重 要组成部分，也是生物技术各领域中最早在水稻方面进入实用化阶段的一种育种方法。我 国自1970年开始水稻花培研究W来，经历了启动、调整、发展Ξ个阶段，在花培方法、诱导手 段、取材世代及群体规模等研究上不断完善、创新，培育出了大量花培品种、恢复系及不育 系等，为品种改良创造了大量的种质资源，为远缘杂交育种、超级稻育种、新株型育种及转 基因育种等现代生物技术的发展提供了重要的技术支撑。[000引1975年我国利用花培育种技术第一次育成了梗稻品种单丰1号，标志着花培技术 在我国常规水稻育种应用的开端。随后利用花培技术育出了很多优良的常规品种，如中花 系列、龙梗系列、京花系列、闽花系列、宁梗系列、早单7301、晚单7号、合单76-085、合江21、 浙梗66号、花寒早、花培528、南抗1号、朝花矮、协优議-8等，通过审定的品种有40多个。不育 系和恢复系的长期使用会发生退化，因此严格的提纯复壮措施非常必要，因此花培育种在 不育系和恢复系的提纯上应用较多。葛美芬等同配套提纯了灿优63的Ξ系材料珍灿97B、珍 灿97A和恢复系明恢63。1993年张家宏等对水稻印尼水田谷6号质源不育系Π-32Α和优IA的 花培提纯获得成功。花培过程产生的变异也为水稻的选育提供了新的遗传基础材料，选育 出了一些应用广泛的新恢复系和新组合。如四川农业大学水稻研究所选育出的花广518、花 广549、花广1357和蜀恢162等广亲和恢复系。张志雄等同利用花培技术选育出了恢复系川 恢802和组合Π优802。另外，由于水稻釉梗杂种和爪釉杂种的后代稳定非常慢，可W对其杂 种后代进行花药培养，加速其杂种后代的稳定，W加速水稻育种的进程。利用花培技术已选 育出了具有良好育性转换特性的光溫敏不育系I-IS-1、I-IS-2、1103S、H1286S、1647S、 ZNDBS和培MS-1 等。 作为世界上最大的稻米生产国和消费国，我国的水稻研究在世界上处于领先地 位。水稻产量的飞跃、品质的改良、对特定环境的适应性、对病、虫、草的水平抗性等等，设及 宏观生态领域与微观基因领域的研究。水稻花药培养是水稻育种在微观领域与宏观领域的 纽带，作用不可忽视。植物的生长受着内部基因与外部环境的双重影响，目前植物组织培养 技术还不能使培养的外部环境与每个个体的生长达到最佳组合，因此该技术还不是很完美 的，具体到每种植物的组织培养还需要在不断的研究当中继续加W改进。水稻花培技术本 身还有很多急需改进的地方，其中培养基的成分包括大量元素、微量元素、维生素W及生长 激素等等的组成及用量还有待于进一步的研究，操作方法等也应深入地研究并简化，才能 保证在水稻育种应用中的高效地位。 现阶段花培育种在花药培养方法上仍存在着工作量大、工作效率低的矛盾，限制 了花培技术在育种中的应用。随着生物技术的快速发展，新的技术不断被创造出来，也为花 培途径育种的应用技术提出更高要求。如何提高工作效率、加快选择效率、缩短育种周期、 创新种质材料、配合其它生物技术的应用，快速获得纯系，充分利用花培技术在基础理论研 究和育种应用研究的雄厚基础，成为我们迫切需要解决的问题。 多年的实验经验发现，花培工作效率低的最重要的原因是花培操作方法的局限 性。剪颖抖药法是目前花药分离最普遍的操作方法，然而，剪颖和抖药过程既需要专业组培 操作，又需要消耗大量的劳动，成为花培操作的限速步骤。如何快捷分离水稻花药，并且保 证分离后水稻花药维持活力且无污染适宜离体培养，是解决花培操作低效的关键。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有花药离体培养操作方法的专业操作要求高且耗时耗力 的缺陷，提供一种提高操作量、工作效率高的离体培养用水稻花药快捷分离方法。 本专利技术的目的是通过W下技术方案解决的： 1. ，其特征在于:所述分离方法的步骤如下： (1) 取穗及预处理； (2) 对预处理后的稻穗进行灭菌； (3) 在无菌条件下将稻穗进行机械分割，切碎的稻穗倒入离屯、管中密封后置于摇床上 震荡； (4) 将初步震荡后的离屯、管放入高速冷冻离屯、机中，20°C条件下9000-10000rpm离屯、获 得离体花药； (5) 对离体花药进行接种培养。 所述步骤（1)中的取穗W稻巷大而不破、剑叶叶枕距为5~8cm、稻穗中部花药位置 占颖壳的1/^3~1/^2为标准取穗。 所述步骤（1)中的预处理过程为:先用75%乙醇表面消毒，然后湿润的纱布包裹整 个稻穗，保持稻穗湿润，最后放到冰箱中，在4°C下低溫预处理2-8天。 所述步骤(2)中的灭菌过程为:预处理后剪下稻巷，将稻巷浸泡于70%的酒精中处 理3~5min，然后将该稻巷转移于超净工作台中剥离稻穗，用消毒过的纱布包裹稻穗后用浓 度为0.1%的升隶灭菌9-llmin并间或摇动，无菌水漂洗3~4次，打开纱布惊干。 所述步骤(3)中切碎的稻穗倒入含有60-80ml的薦糖溶液的100毫升离屯、管中， 盖上离屯、管盖并用保鲜膜将离屯、管盖头位置紧紧封闭。 所述步骤(3)中密封的离屯、管从超净工作台中取出后置于摇床上进行300-40化pm 震荡 5-lOmin。 所述步骤(3)中的稻穗按照2.2-2.8mm/段进行机械分割。 所述步骤(4)中的离体花药需要放回超净工作台后倒入盛有已灭菌的薦糖溶 液容器。 所述步骤巧）中的离体花药接种培养过程为：用灭菌过的网筛勺揽动装有离体花 药的薦糖溶液，使离体花药均匀分散，然后圉出，使得离体花药均匀分散到网筛勺上，控出 液滴，将离体花药磕到装有诱导培养基的培养瓶内，26-28°C暗培养，诱导出愈伤组织。 所述的网筛勺的孔径为48目-70目。 本专利技术相比现有技术有如下优点： 本专利技术通过创造性地对水稻花药采取机械切割的方式进行破碎，然后根据具体需要采 用不同大小的离屯、力对碎片进行分离，成功提取到了纯净的水稻花药，并通过优化离屯、介 质和采用无菌操作，成功获取到了本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种离体培养用水稻花药快捷分离方法，其特征在于：所述分离方法的步骤如下：（1）取穗及预处理；（2）对预处理后的稻穗进行灭菌；（3）在无菌条件下将稻穗进行机械分割，切碎的稻穗倒入离心管中密封后置于摇床上震荡；（4）将初步震荡后的离心管放入高速冷冻离心机中，20℃条件下9000‑10000rpm离心获得离体花药；（5）对离体花药进行接种培养。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：不公告发明人，
申请(专利权)人：安徽袁粮水稻产业有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34