本发明专利技术公开了一株高产单萜香叶醇的重组酿酒酵母菌株，该菌株名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YZG13-GE1，基因型为：pZGV6-GE1，pZMVA4，菌株已于2015年09月25日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为CGMCC No.11465。实验证实本发明专利技术所述的重组酿酒酵母菌株在摇瓶发酵生产单萜香叶醇过程中即可获得66mg/L香叶醇，分批发酵能够产生192mg/L香叶醇，而在补料分批发酵过程中，香叶醇最高产量可达292mg/L，比之前文献报道的产量高出8倍，为目前报道的利用酿酒酵母合成香叶醇的最高产量。本发明专利技术所述的重组酿酒酵母菌株对于利用廉价原料通过发酵法生产香叶醇及其衍生产物如抗癌单萜类生物碱具有重要的意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及，属于微生物技术 领域。
技术介绍
萜类化合物（又称异戊二烯类化合物）是自然界中广泛存在的一类具有巨大应用 价值的天然化合物，主要包括单萜类、倍半萜类、双萜类、多萜类等。萜类化合物可作为香 料、生物燃料、药物、色素等，具有广阔的应用前景。例如，单萜类香叶醇、柠檬烯可用作香 料，薇稀的二聚物可作为航空燃料；倍半砲类amorphadiene和青蒿酸为重要的抗疱疾药物 青蒿素的前体，甜没药烯、法呢烯衍生物可作为生物燃料替代柴油及航空燃油；双萜类紫杉 醇是一种有效的抗癌药物；多萜类人参皂苷以及各种类胡萝卜素等都是重要的生物活性物 质。萜类化合物种类繁多，结构复杂，化学合成困难，目前主要从天然植物中直接提取，这不 仅造成植物资源的浪费，而且分离纯化产率很低。随着生物合成技术的不断发展，通过改造 微生物细胞，使之成为能利用利用廉价的底物高效合成萜类化合物的细胞工厂，可以大大 降低生产成本，具有广泛的应用前景。其中，香叶醇为一种重要的单萜，是玫瑰精油的主要 成分，除了被广泛用做香料，调味品之外，还可被用作抗菌剂和合成多种抗癌单萜类生物碱 的前体。 异戊烯基焦磷酸（isopentenyldiphosphate，IPP)是合成砲类化合物的最关 键的前体，可以由自然界中两条独立的生物合成途径合成。一条是甲羟戊酸途径（MVA pathway)，存在于古细菌、少数细菌以及大多数真核生物中；另一条是2-甲基赤藓醇-4-磷 酸途径（MEPpathway)，存在于大多数细菌以及蓝藻中。绿色植物中同时存在这两条途径。 目前，通过改造微生物细胞中内源的MEP或者MVA途径过量合成萜类化合物的前体，同时引 入异源的萜类合成途径，实现了多种萜类化合物的微生物合成，主要以倍半萜合成为主。 酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae)作为真核模式生物，具有生长速度快、抑 制物耐受性高，优良的工业生产特性以及成熟的遗传操作体系使其成为最具潜力的微生物 细胞工厂之一。酿酒酵母细胞中的MVA途径主要用于合成细胞膜的重要组分麦角固醇，以 维持细胞的正常生长。倍半萜是利用酿酒酵母合成的最为广泛的萜类化合物，例如青蒿酸 产量可达25g/L，甜没药烯可达900mg/L等；然而其它萜类化合物如单萜，双萜和三萜则产 量较低，大多低于50mg/L。尤其是单萜的合成，由于酿酒酵母细胞本身缺乏香叶基焦磷酸合 成酶，故不能有效合成单萜合成的直接前体香叶基焦磷酸（GPP)，这就大大降低了单萜的产 量。另外，单萜对细胞的毒性也是限制其产量的重要因素之一。 基于上述单萜合成的限制性因素，经检索通过调节细胞中GPP的合成以及功能性 表达高活性的香叶醇合成酶构建高产香叶醇的酿酒酵母重组菌株的专利及文献还未见报 道。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术要解决的问题是提供一株高产单萜香叶醇的重组酿 酒酵母菌株及其在发酵制备香叶醇中的应用。 本专利技术所述高产单萜香叶醇的重组酿酒酵母菌株，其特征在于：所述菌株名为酿 酒酵母（Saccharomycescerevisiae)YZG13_GEl，该菌株基因型为：pZGV6_GEl，pZMVA4,已 于2015年09月25日保藏在"中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北 京市朝阳区北辰西路1号院3号）"，保藏编号为CGMCCNo. 11465。 本专利技术所述高产单萜香叶醇重组酿酒酵母菌株构建方法概述：将含有香叶醇 合成酶和法呢基焦磷酸合成酶突变体融合蛋白基因tV〇GES-ERG20F96WNmw的表达载体 PZGV6-GE1与含有异戊烯基二磷酸异构酶基因IDI1、HMG-CoA还原酶基因tHMGl和留醇调 节转录因子基因UPC2-1表达载体pZMVA4共转化酿酒酵母单倍体菌株CEN.PK102-5B，得到 含有两个质粒的重组酿酒酵母菌株YZG13-GE1，即为高产单萜香叶醇的重组酿酒酵母菌株。 上述技术方案较具体的步骤是：构建质粒PZGV6-GE1，通过融合PCR的方法构建 香叶醇合成酶和法呢基焦磷酸合成酶突变体融合蛋白基因tV〇GES-ERG20F96WNmw，然后通过 GibsonAssembly的方法将上述基因克隆到表达载体pJFE3的BamHI/PstI位点处得到表 达载体PZGV6-GE1 ;构建辅助质粒pJFE3-UPC2-l，将留醇调节转录因子基因UPC2-1克隆到 表达载体PJFE3的BamHI/Sbfl位点得到表达载体pJFE3-UPC2-l;构建质粒pZMVA4,将异 戊烯基二磷酸异构酶基因IDI1克隆到表达载体pIYC04的BamHI/Sall位点处得到表达载 体pZMVAl，再将HMG-CoA还原酶基因tHMGl基因通过GibsonAssembly的方法克隆到表达 载体pZMVAl的Spel位点得到表达载体pZMVA2,最后将从辅助质粒pJFE3-UPC2-l扩增得 到的UPC2-1的表达框TEFlp-UPC2-l-PGKlt片段通过GibsonAssembly的方法克隆到表达 载体PZMVA2的Kpn2I位点处，得到表达载体pZMVA4;将质粒pZGV6-GEl和质粒pZMVA4共 转化酿酒酵母单倍体菌株CEN.ΡΚ102-5Β，得到重组酿酒酵母菌株YZG13-GE1，其基因型为： PZGV6-GE1,pZMVA4〇 进一步的，上述技术方案的实施步骤是： (1)含有香叶醇合成途径中关键基因表达框的表达载体的构建： ①质粒PZGV6-GE1 :用于表达融合基因tVoGES-ERG20(ra6WNmw)，以尿嘧啶为筛选标 记。其中tVoGES为来源于Valerianaofficinalis的香叶醇合成酶（VoGES)(Accession no.KF951406)，且以酿酒酵母为表达宿主进行密码子优化和删除导肽序列；ERG20(F96WNmw) 为酿酒酵母内源基因ERG20突变体。 ②质粒pZMVA4:用于表达香叶醇合成上游途径（即酿酒酵母内源的MVA途径）的 关键基因IDI、tHMGl、UPC2-1，以组氨酸为筛选标记。 (2)高产单萜香叶醇的重组酿酒酵母菌株的构建： 将步骤（1)中的pZGV6-GEl和pZMVA4两个质粒同时转化酿酒酵母CEN.PK102B菌 株，通过SD-Ura-His培养基（酵母基础氮源yeastnitrogenbase1.7g/L，葡萄糖glucose 20g/L，硫酸铵（NH4)2S045g/L，缺尿嘧啶和组氨酸的氨基酸混合物CSM-Ura-His0. 65g/L) 筛选得到转化成功的转化子，即为重组酿酒酵母菌株YZG13-GE1。 本专利技术所述高产单萜香叶醇的重组酿酒酵母菌株在发酵生产香叶醇中的应用。 本专利技术所述高产单萜香叶醇的重组酿酒酵母菌株在发酵生产香叶醇衍生产物 (如抗癌单萜类生物碱）中的应用。 以不同发酵方式对重组酿酒酵母菌株YZG13-GE1测试产生香叶醇的影响，结果显 示本专利技术所述高产单萜香叶醇的重组酿酒酵母菌株产量是目前文献报道最高产量（36mg/ L)的8倍。具体的： ①好氧摇瓶发酵：40mLSD-Ura-His培养基中添加4mL十二烷作为萃取剂，初始接 种0D6。。为0.2,培养48小时，香叶醇产量达到最本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株高产单萜香叶醇的重组酿酒酵母菌株，其特征在于：所述菌株名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YZG13‑GE1，该菌株基因型为：pZGV6‑GE1，pZMVA4，已于2015年09月25日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为CGMCC No.11465。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：侯进，鲍晓明，赵建志，沈煜，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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