本发明专利技术涉及一种基于IL-8基因判断云南地方鸡抗病能力强弱的方法，属于动物分子育种的基因工程技术领域；所述的基于IL-8基因判断云南地方鸡抗病能力强弱的方法包括以下具体步骤为：1）总RNA的提取；2）RNA沉淀的清洗；3）RNA的溶解；4）总RNA纯度、浓度及完整性检测；5）总RNA电泳检测；6）PCR引物设计；7）检测IL-8基因的表达量来基于IL-8基因判断云南地方鸡抗病能力的强弱，在肝脏、脾脏、胸腺、法氏囊四个组织中的表达量高的云南地方鸡不容易遭受环境变化影响和被病原微生物感染，在脾脏、胸腺、法氏囊三个组织中的表达量高的云南地方鸡免疫机能较强。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于动物分子育种的基因工程
，具体涉及一种基于IL-8基因判断 云南地方鸡抗病能力强弱的方法。
技术介绍
免疫抗病研究是现代家禽育种研究的一大热点。家禽的品种、养殖环境、饲料等都 会在实际生产过程中对禽类的抗病力产生影响，但禽类机体自身固有免疫代谢能力在机体 抗病效应中的表现中有着举足轻重的地位，所以，准确认识动物机体免疫器官在不同时间 阶段免疫相关基因的表达特性，是免疫抗病研究的基础。白细胞介素-8(Interleukin-8，IL-8)是一种能激活嗜中性粒细胞的趋化性细胞 因子(Chemokine，chemotacticcytokine)，是一种具有内源性白细胞趋化性和活化性作用 的碱基-肝素结合性蛋白质。趋化性细胞因子是一类由组织细胞和炎性细胞衍生的、具有白 细胞趋化活性的肽分子，为一小分子生物活性肽家族。1988年Matsushima等首先报道人IL-8序列，并将其基因定位于4ql2_q21，基因全长3211bp，包括4个外显子和3和内含子。1993年 Barker等报道了第一份关于鸡IL-8基因的研究，结果表明鸡IL-8基因同人类IL-8基因结果 一样，包含4个外显子和3个内含子，其中鸡的第二个内含子要比人的大，而哺乳类IL-8的第 二个内含子把一个开放阅读框给隔开。鸡的IL-85'非翻译区的启动子处有保守的NF-1和 NF-kB结合位点，缺乏AP-1和CCAT盒，但存在潜在的AP-1结合位点和CCAT盒和其它的转录结 合位点如IRF-1和八聚体，同时鸡IL-8基因的启动子处还含有GAAT基序，这是鸡IL-8基因所 特有的。IL-8可以趋化嗜中性粒细胞等多种免疫细胞到病变部位，促进这些细胞活化，引起 炎症反应，在动物机体的疾病防御中起着重要的作用。在动物和人体胰腺炎中均检测到IL-8的表达上调。张鑫宇等人对鸡马立克氏病病毒(CMDV)类白细胞介素8(yIL-8)基因进行了 克隆和表达，并测定它的趋化性。同时人类医学研究也表明，人类多种肿瘤细胞均可高表达 IL-8，IL-8在癌症的发生发展中起着十分重要的作用。
技术实现思路
本专利技术提供一种基于IL-8基因判断云南地方鸡抗病能力强弱的方法，采用分子生 物学技术和生物信息学分析方法，在对云南地方鸡IL-8基因mRNA表达量的研究中发现IL-8 基因与免疫功能相关，通过云南地方鸡IL-8基因mRNA在云南地方鸡的肝脏、脾脏、胸腺、法 氏囊四个组织中的表达量，判断云南地方鸡免疫机能的强弱，在肝脏、脾脏、胸腺、法氏囊四 个组织中的表达量高的云南地方鸡不容易遭受环境变化和被病原微生物感染，在肝脏、脾 脏、胸腺、法氏囊四个组织中的表达量高的云南地方鸡免疫机能较强。为了达到上述目的，本专利技术提出如下技术方案： -种基于IL-8基因判断云南地方鸡抗病能力强弱的方法，包括以下具体步骤为： 1)RNA的提取①选取同一批次出壳的四个品种(武定鸡、盐津乌骨鸡、茶花鸡、大围山微型鸡)健 康鸡只120只进行隔离饲养，分别于4、8、12周龄屠宰，采集各个鸡只的肝脏、脾脏、胸腺、法 氏囊组织，将采集的组织进行低温冷冻，将低温冻结的组织样品称量后转移至用液氮预冷 的研钵中，用研件研磨组织，其间不断加入液氮，直至研磨成粉末状;加入lmlRNAisoPlus (宝生物公司）。②将匀浆液转移至离心管中； ③向匀浆裂解液中加入RNAisoPlus体积量1/5的氯仿，紧盖离心管盖，混合至溶 液乳化呈乳白色； ④室温静置5分钟； ⑤在4°C条件下离心15分钟，从离心机中取出离心管，此时匀浆液分为三层，S卩：无 色的上清液(含RNA)、中间的白色蛋白层(大部分为DNA)及带有颜色的下层有机相；⑥吸取上清液转移至另一个离心管中，向上清液中加入0.5-1倍RNAisoPlus体积 的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，室温下静置10分钟； ⑦4°C条件下离心10分钟； 2)RNA沉淀的清洗弃去上清，加入与RNAisoPlus等量的75%乙醇，轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁， 在4°C条件下离心5分钟后小心弃去上清； 3)RNA的溶解 打开离心管盖，室温干燥沉淀，沉淀干燥后，加入RNase-free水溶解沉淀，最后将 RNA溶液贮存于_80°C; 4)总RNA纯度、浓度及完整性检测 取lyL总RNA溶于99yL无RNase水中，用蛋白质核酸检测仪测总RNA在0D260nm、 0D280nm的吸光值，并求出两者的的比值； 5)总RNA电泳检测取3yL总RNA样品经1%琼脂糖凝胶电泳20min后，在凝胶紫外线投射仪下观察电泳 结果； 6)PCR引物设计 根据GenBanK中原鸡(Gallusgallus)的相关基因序列，使用引物设计软件primer 5.0设计引物，并合成，合成后用荧光定量PCR; 7)检测IL-8基因的表达量检测云南地方鸡肝脏、脾脏、胸腺、法氏囊四个组织中E-8基因的表达量。 进一步，其特征在于:在步骤1)总RNA的提取①中加入lmlRNAisoPlus(宝生物公 司）。进一步，在步骤1)总RNA的提取③中加入RNAisoPlus体积量1/5的氯仿。进一步，在步骤1)总RNA的提取⑤中溶液分层为三层，三层分别为:无色含RNA的上 清液、白色的中间蛋白层及带有颜色的下层有机相。 进一步，步骤6)PCR引物设计中用于荧光定量的IL-8基因的引物序列为：F:5 '-ATGAACGGCAAGCTTGGA-3 '； R:5，-GCAGTGGGGGCCGCTTGG-3，； 内参18SrRNA的引物序列为： F:5 '-TGGACTCCTACAACCAACGG-3 ' R:5 '-CATCCTCCTTGAACTCGCAG-3 ' 荧光定量PCR的反应条件为:95°C预变性2min; 94°C变性15s，59.2°C退火30s、72°C 延伸30s，40个循环。进一步，所述的云南地方鸡包括大围山微型鸡、茶花鸡、盐津乌骨鸡、武定鸡。本专利技术的有益效果：本专利技术对抗菌肽IL-8基因设计引物，进行PCR扩增，检测IL-8基因mRNA在云南地方 鸡在肝脏、脾脏、胸腺和法式囊四个组织的表达量，在肝脏、脾脏、胸腺、法氏囊四个组织中 表达量高的云南地方鸡更容易遭受环境变化、病原微生物感染，在肝脏、脾脏、胸腺、法氏囊 四个组织中的表达量高的云南地方鸡免疫机能较强，对云南地方鸡优良品种的相关基因进 行研究，不但可以进一步了解云南地方鸡种抗病力强的原因，为揭示云南地方鸡抗病力遗 传特性提供理论依据，而且可以对云南地方鸡鸡种品质资源的保护、利用和创新起到积极 的作用，并指导地方鸡种的杂交改良、品种(系）的培育，为鸡抗逆生理机制和抗病育种研究 提供参考。【附图说明】图1是本专利技术的IL-8基因在四个云南地方鸡种沙门氏菌病感染率比较分析图；图2是本专利技术的IL-8基因在四个云南地方鸡种肝脏中的表达比较分析图；图3是本专利技术的IL-8基因在四个云南地方鸡种脾脏中的表达比较分析图；图4是本专利技术的IL-8基因在四个云南地方鸡种胸腺中的表达比较分析图；图5是本专利技术的IL-8基因在四个云南地方鸡种法氏囊中的表达比较分析图。【具体实施方式】如图1-5所示，下面将结合本专利技术的实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于IL‑8基因判断云南地方鸡抗病能力强弱的方法，其特征在于：具体包括以下步骤：1)RNA的提取①选取同一批次出壳的云南地方鸡的健康鸡只120只进行隔离饲养，分别于4、8、12周龄屠宰，采集各个鸡只的肝脏、脾脏、胸腺、法氏囊组织，将采集的组织进行低温冷冻，将低温冻结的组织样品称量后转移至用液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组织，其间不断加入液氮，直至研磨成粉末状；加入RNAiso Plus；②将匀浆液转移至离心管中；③向匀浆裂解液中加入RNAiso Plus体积量1/5的氯仿，紧盖离心管盖，混合至溶液乳化呈乳白色；④室温静置5分钟；⑤在4℃条件下离心15分钟，从离心机中取出离心管，此时匀浆液分为三层，即：无色的含RNA上清液、中间的含DNA的白色蛋白层及带有颜色的下层有机相；⑥吸取上清液转移至另一个离心管中，向上清液中加入0.5‑1倍RNAiso Plus体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，室温下静置10分钟；⑦4℃条件下离心10分钟；2)RNA沉淀的清洗弃去上清，加入与RNAiso Plus等量的75％乙醇，轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，在4℃条件下离心5分钟后小心弃去上清；3)RNA的溶解打开离心管盖，室温干燥沉淀，沉淀干燥后，加入RNase‑free水溶解沉淀，最后将RNA溶液贮存于‑80℃；4)总RNA纯度、浓度及完整性检测取1μL总RNA溶于99μL无RNase水中，用蛋白质核酸检测仪测总RNA在OD260nm、OD280nm的吸光值，并求出两者的的比值；5)总RNA电泳检测取3μL总RNA样品经1％琼脂糖凝胶电泳20min后，在凝胶紫外线投射仪下观察电泳结果；6)PCR引物设计根据GenBanK中原鸡(Gallus gallus)的相关基因序列，使用引物设计软件primer 5.0设计引物，并合成，合成后进行荧光定量PCR；引物序列为F:5’‑ATGAACGGCAAGCTTGGA‑3’；R:5’‑GCAGTGGGGGCCGCTTGG‑3’；7)检测IL‑8基因的表达量检测云南四个地方鸡种肝脏、脾脏、胸腺、法氏囊四个组织中IL‑8基因的表达量，荧光定量PCR的反应条件为：95℃预变性2min；94℃变性15s，59.2℃退火30s、72℃延伸30s，40个循环。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：贾俊静，赵筱，葛长荣，李琦华，刘丽仙，张彦华，佟荟全，胡文元，黄英，李正田，荣华，程志斌，徐志强，豆腾飞，曹振辉，谷大海，
申请(专利权)人：云南农业大学，
类型：发明
国别省市：云南;53
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