一种借助宿主细胞的病毒包膜叶酸修饰方法技术

本发明专利技术涉及一种借助宿主细胞的病毒包膜叶酸修饰方法。首先将叶酸功能化磷脂加入到包膜病毒宿主细胞的培养基中，利用细胞自身的代谢及细胞膜的流动性实现宿主细胞膜系统的叶酸修饰。继而用包膜病毒感染宿主细胞，利用病毒在宿主细胞膜系统上出芽获得包膜的过程，自然地实现病毒包膜的叶酸修饰。本方法将叶酸功能化磷脂嵌入病毒包膜的磷脂双分子层，因此不影响包膜病毒表面蛋白结构及其对细胞的识别功能。由于无需通过剧烈的化学反应或繁琐的基因工程方法改造病毒，有利于保持病毒的感染力。本发明专利技术可应用于病毒对非宿主细胞的靶向识别及转导。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于化学、病毒学、生物科学领域，具体涉及。
技术介绍
包膜病毒在新型肿瘤治疗基因载体开发等方面有着广阔的应用前景。然而，由于包膜病毒不能特异性地识别肿瘤细胞，极大地限制了其应用。叶酸受体在很多肿瘤细胞表面高表达，而在正常细胞表面则表达程度很低，因此叶酸已成为一种广谱的肿瘤细胞靶向分子。目前的病毒包膜叶酸修饰主要采用基因工程改造和化学修饰两种方法，但基因工程改造方法耗时长、操作繁琐、修饰配体受到限制，而化学修饰方法操作繁琐且可能影响病毒的感染力。因此，借助宿主细胞的自然代谢及包膜病毒在细胞内的扩增实现病毒包膜的叶酸修饰是一种更优的选择。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于针对现有技术的不足提供。本专利技术将叶酸功能化磷脂加入宿主细胞培养基，利用细胞自身的代谢及细胞膜的流动性，在细胞培养过程中将叶酸功能化磷脂自然嵌入细胞膜系统。以包膜病毒感染叶酸修饰的宿主细胞，利用病毒在出芽过程中从宿主细胞膜系统上获得包膜的过程，实现病毒包膜的叶酸修饰(如图1所示)。本专利技术方法具体包括如下步骤: 1.将叶酸功能化磷脂加入到宿主细胞培养基中，在细胞自然代谢过程中，叶酸功能化磷脂自然嵌入细胞膜系统，得到叶酸修饰的宿主细胞； 2.用包膜病毒侵染叶酸修饰的宿主细胞，病毒在出芽过程中从宿主细胞膜系统上获得叶酸修饰的包膜，自然地实现病毒包膜的叶酸修饰； 3.细胞全部出现病变时收集细胞上清液并纯化和浓缩，得到包膜修饰叶酸的病毒。只需正常纯化病毒，无需多余操作，即可得到叶酸修饰的包膜病毒。上述方法中，叶酸功能化磷脂的浓度是0.03-0.30mg/mL ;另外，可在包膜病毒的培养过程中继续添加叶酸功能化磷脂，以加强叶酸修饰。本专利技术借助细胞自身的代谢及细胞膜系统的流动性，在细胞培养过程中自然地将叶酸功能化磷脂嵌入细胞膜系统。利用包膜病毒感染叶酸修饰的宿主细胞，病毒在扩增过程中自然地从叶酸功能化的宿主细胞膜系统上获得自身包膜，实现病毒包膜的叶酸修饰。与其它病毒包膜叶酸修饰方法相比，本专利技术方法借助了病毒在宿主细胞内的扩增，操作简便、条件温和，无需通过剧烈的化学反应或繁琐的基因工程方法修饰病毒，最大限度地保持了包膜病毒的完整性及感染力，有利于实现病毒对非宿主细胞的靶向识别。【附图说明】图1为包膜病毒叶酸修饰的流程示意图。图2为证明叶酸功能化磷脂对宿主细胞无毒的MTT图。图3为证明宿主细胞被叶酸功能化磷脂修饰的免疫荧光图，标尺为5 Mm。图4为证明包膜病毒叶酸修饰的免疫荧光共定位图，标尺为5Mm。图5为叶酸修饰包膜病毒(a)及野生型包膜病毒(b)的透射电子显微镜图，标尺为 100 nm。图6为叶酸修饰包膜病毒(a)及野生型包膜病毒(b)的感染力测定。图7为叶酸修饰杆状病毒(a)及野生型包膜病毒(b)在叶酸受体高表达细胞表面吸附的荧光图，标尺为10 Mm。图8为叶酸修饰伪狂犬病毒(a)及野生型包膜病毒(b)在叶酸受体高表达细胞表面吸附的荧光图，标尺为10 Mm。【具体实施方式】通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本专利技术的特点和优点。所提供的实施例仅是对本专利技术方法的说明，而不以任何方式限制本专利技术揭示的其余内容。下列实施例中未注明的具体实验条件和方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。借助宿主细胞的杆状病毒包膜叶酸修饰 下面以杆状病毒包膜的叶酸修饰为例，对本专利技术方法进行详细的说明。一、方法 1.宿主Sf9细胞的叶酸修饰:28° C下，将杆状病毒宿主Sf9细胞在含有0.03-0.30mg/mL 叶酸功能化磷脂 DSPE-PEG2000-FA (美国 NAN0CS，货号 PG2_DSFA_2k，纯度>85%)及10%胎牛血清FBS的Grace’s培养基中悬浮培养至细胞密度达约1.0X 106个/mL。2.杆状病毒包膜的叶酸修饰:取2 mL叶酸修饰的宿主Sf9细胞接种于细胞培养皿中，在含有0.03-0.30mg/mL叶酸功能化磷脂DSPE-PEG2000-FA及10%胎牛血清FBS的Grace’ s培养基中继续培养至细胞密度达到约80%时，按感染复数Μ0Ι = 0.5接种杆状病毒。3.包膜修饰叶酸的杆状病毒的获得:当细胞全部出现病变时收获上清液，6500rpm下离心15 min，上清液经0.45 Mm滤膜过滤，22300 rpm下超速离心3 h，获得纯化后的叶酸修饰杆状病毒。二、结果1.叶酸修饰的宿主Sf9细胞的表征:采用MTT实验考察了叶酸功能化磷脂DSPE-PEG2000-FA对宿主Sf9细胞的毒性(图2)。结果表明，将宿主Sf9细胞在含有0.03-0.30mg/mL DSPE-PEG2000-FA的细胞培养基中培养7天，未对细胞产生明显毒性。将Dylight 488标记的叶酸抗体与宿主Sf9细胞孵育，结果如图3所示。在含有0.03 mg/mLDSPE-PEG2000-FA的细胞培养基中获得的宿主Sf9细胞表面即有明显的荧光信号，表明利用叶酸功能化磷脂与宿主Sf9细胞的孵育，实现了宿主Sf9细胞表面的叶酸修饰。上述结果表明，采用MTT方法获得的宿主Sf9细胞安全的DSPE-PEG2000-FA最低浓度0.03mg/mL,即可实现对宿主Sf9细胞的叶酸修饰。2.杆状病毒包膜叶酸修饰效率的表征:采用感染复数Μ0Ι = 0.5的衣壳蛋白VP39上融合表达绿色荧光蛋白GFP的杆状病毒感染叶酸修饰的宿主Sf9细胞，获得了子代杆状病毒。利用GFP的绿色荧光信号与Dylight 649标记叶酸抗体的红色免疫荧光信号的共定位表征了叶酸对病毒包膜的修饰效率(图4)。结果表明，利用叶酸修饰的宿主Sf9细胞，获得杆状病毒的荧光共定位效率达到85.9 土 1.2% (N = 200)，证明借助宿主细胞膜的叶酸修饰，实现了叶酸对杆状病毒的高效修饰。3.叶酸修饰杆状病毒的透射电子显微镜表征:米用高分辨透射电子显微镜(TEM)对叶酸修饰杆状病毒及野生型杆状病毒的结构进行了表征。如图5所示，叶酸修饰获得的杆状病毒结构与野生型杆状病毒结构无明显差异，说明采用本专利技术方法对杆状病毒进行修饰，未对病毒造成明显的损伤。4.叶酸修饰杆状病毒的感染力测定:分别以感染复数Μ0Ι=0.5的叶酸修饰杆状病毒及野生型杆状病毒感染宿主Sf9细胞。当细胞全部出现病变时，收集细胞上清液，采用半数组织培养感染剂量(TCID50)方法测定了二者上清液的滴度(图6)。结果表明，叶酸修饰杆状病毒的感染力与野生型杆状病毒的感染力基本一致，说明采用本专利技术方法对杆状病毒进行叶酸修饰，能够保持修饰病毒的感染能力。5.叶酸修饰杆状病毒对叶酸受体高表达细胞的识别:口腔表皮样癌KB细胞是一种叶酸受体高表达的肿瘤细胞。分别将叶酸修饰杆状病毒与野生型杆状病毒加入到KB细胞中(M0I=200)，4° C吸附1 h后固定并进行荧光成像。如图7所示，未经修饰的杆状病毒吸附量要明显小于叶酸修饰的杆状病毒吸附量，说明通过对杆状病毒的叶酸修饰，可以实现其对叶酸受体高表达的KB肿瘤细胞的特异性识别。借助宿主细胞的伪狂犬病毒包膜叶酸修饰 下面以伪狂犬病毒包膜的叶酸修饰为例，对本专利技术方法进行详细的说明。一、方法 1.宿主BHK21细胞的叶酸修饰:37° C下，将伪狂犬病毒宿主BHK21细胞在含本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种包膜病毒的叶酸修饰方法，其特征在于，用经叶酸修饰的细胞扩增包膜病毒。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：林毅，王丽英，文莉，吕诚，庞代文，王汉中，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42