一种用于检测猪水泡病病毒的Taqman Real-time RT-PCR试剂盒及其使用方法，所述试剂盒包含One Step RT-PCR buffer 、酶混合物、阳性对照、无RNA酶水、序列SEQ ID NO:1和 SEQ ID NO:2的引物及SEQ ID NO:3的探针引物的混合物；所述使用方法包括使用所述试剂盒进行RT-PCR扩增的步骤及评定标准。本发明专利技术设计了特异性针对猪水泡病病毒的引物及探针，经过前期试验筛选后选取灵敏度和特异性良好的引物及探针，优化反应条件和引物探针应用浓度，优化并组装成试剂盒。本发明专利技术能快速、敏感、准确以及低成本地对猪水泡病病毒进行检测及定量分析。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及猪水泡病防治
，具体说是一种用于检测猪水泡病病毒的 TaqmanReal-timeRT-PCR(探针法实时定量反转录-聚合酶链反应）试剂盒，本专利技术还包 括该试剂盒的使用方法。
技术介绍
猪水疱病（swinevesiculardisease,SVD)又称猪传染性水疱病，是由肠道病毒 属的猪水疱病病毒（swinevesiculardiseasevirus,SVDV)引起的一种急性、热性、高度 接触性传染病。该病首次发现于1966年，以流行性强，发病率高，蹄部、口部、鼻端和腹部、 乳头周围皮肤和粘膜发生水疱为特征。在症状上与口蹄疫极为相似，但牛、羊等家畜不发 病。从临床角度看，猪水疱病一般只对猪的肥育计划产生轻微的影响，但本病的症状与口蹄 疫的症状很难区别，从而妨碍了猪和猪产品的流通与国际贸易，引起严重的公共卫生问题， 国际兽疫局将其列为A类动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。自然条件下，只有猪感染，且不分品种、年龄、性别。病猪、潜伏期和痊愈带毒猪是 主要传染来源。病猪的粪、尿、唾液、奶水、水泡皮和屠宰后的内脏、下水等污染饲料、饮水和 周围环境，病毒可通过健康猪的消化道感染发病，也可经皮肤、粘膜的伤口感染。SVDV发生 没有明显季节性，但冬春寒冷季节较为多发。本病潜伏期2-5天，有的长达7-8天，猪群感 染此病后，起初跛行、突然拒食，很快波及整个猪群。典型病猪，初期蹄部肿胀、充血、体温升 高至40-41°C，不久在蹄叉、蹄冠和蹄踵出现水泡，水泡内充满透明液体，随后水泡破裂形成 溃疡，也可在破溃处引起继发感染，有些水泡性损伤见于鼻、舌和颈部及下腹部的皮肤，发 病率10-100%不等，严重影响养猪业的发展。目前，我国对SVD的防治策略主要是预防接种，使用传统的灭活疫苗。传统疫苗一 方面在控制病毒病流行方面做出了巨大贡献，但另一方面它具有许多难以克服的缺陷，如 因抗原变异而形成的株特异性、免疫反应的MHC限制性、灭活后病原体的污染问题等。使得 诊断和预防难度越来越大，如今，国内、外已建立的诊断猪水泡病的方法有MAC-ELISA(酶 联免疫吸附实验）、RT_PCR(反转录-聚合酶链反应）检测方法、RT-套式PCR(RT-nPCR)等， 该方法直接从猪的血液、鼻试子、扁桃体、粪便等中扩增出预期的片断，但是上述方法耗时 长，扩增结束后还需要进行电泳才能观察结果，检测一份样品需耗时7小时左右。同时SVDV 是一种高度传染性的病毒，其RNA(核糖核酸）特别容易发生变异，现有的检测方法不具有 快速，敏感和准确的特点，需要研制并开发出快速，敏感、准确以及价格便宜的SVDV检测试 剂盒。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有技术不能适应准确、快速和敏感的检测需 求，从而提供一种用于能够快速、敏感、准确地检测猪水泡病病毒的TaqmanReal-time RT-PCR试剂盒，本专利技术还提供该试剂盒的使用方法。本试剂盒及其使用方法还适用于检测 低微含量的猪水泡病病毒。 为解决上述问题，本专利技术采用了下述技术方案： -种用于检测猪水泡病病毒的TaqmanReal-timeRT-PCR试剂盒，所述试剂盒包 含OneSt印RT-PCRbuffer、酶混合物、阳性对照、无RNA酶水、序列SEQIDN0:1和SEQID NO:2的引物及SEQIDNO:3的探针引物的混合物。 所述序列SEQIDNO: 1至SEQIDN0:2的引物混合物包括： SEQIDN0:1 :上游引物CTCGCCGTTCGTTCTCGCATCC SEQIDN0:2 :下游引物GACCGGGCAACACTCCTCATCACA 探针引物序列为： SEQIDN0:3：CAATGCAGGGTCAGTTAACGCCCCCACGGTC 所述探针引物的5'端标记物为FAM报告荧光基团、3'端标记物为TAMRA淬灭荧光 基团。SEQIDN0:1至SEQIDN0:2的由5'端向3'端延长的序列：SEQIDN0:4(187bp)： 所述阴性对照为无RNA酶水。 所述阳性对照为含有猪水泡病基因序列的阳性质粒pGM-SVDV，其构建方式如下：a.猪水泡病基因组RNA的提取按QIAGENRNeasyMiniKit说明书进行操作。以 提取的病毒RNA为模板进行反转录合成CDNA。以SEQIDN0:1及SEQIDN0:2作为引物 扩增，反应条件为94°C预变性3min;94°C变性50s，60°C退火50s，72°C延伸50s，共35个循 环；72°C再延伸8min，4°C5min。PCR产物于10g/L的琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定。 b.PCR产物的克隆及序列分析 PCR产物用TaKaRa公司的胶回收试剂盒回收，将回收产物与pGEM-TEasy载体连 接，转化大肠杆菌感受态细胞JM109,涂布于含100mg/L氨苄青霉素的LB平板上，37°C培养 12~16h。经蓝白斑筛选后，用质粒（小量）提取试剂盒提取质粒，将序列测定正确的质粒 命名pGM-SVDV，应用Nanodrop2000核酸蛋白分光光度计测定质粒浓度为362ng/ul，计算出 其拷贝数为1. 14X10n(C〇pieS/Ul，拷贝数/微升），本专利技术的试剂盒利用1. 14xl07(C〇pieS/ ul)浓度的质粒作为阳性对照以及利用其倍比稀释后作为标准曲线。 本专利技术还提供了所述试剂盒用于检测猪水泡病病毒的使用方法，包括以下步骤： 实时荧光定量RT-PCR，反应体系如下： a.OneStepRT-PCRbuffer:12. 5 份；b.弓丨物浓度均为lOpmol/μ1的三条引物混合液3份，其中上游引物1份，下游引 物1份，探针引物1份； c.酶混合物1份；d.无RNA/DNA酶水 5. 5 份；e.提取样品的RNA模板3份； f.阳性对照pGM-SVDV阳性质粒3份； g.阴性对照无RNA/DNA酶水3份。 实时荧光定量RT-PCR，扩增条件如下： 42°(：反转录51^11;94°(：预变性21^11;94 1€2〇8，退火温度6〇1€3〇8,721€2〇8,40个 循环。 根据扩增结果，判定标准为： 在NTC没有Ct值的情况下，Ct值〈35判为阳性；Ct值介于35-40为可疑，需重复 检测。再次测定时该样品Ct值〈35为阳性，Ct值多35为阴性。也可以依扩增得到的Ct值 根据标准曲线对样品进行准确定量。 本专利技术设计了特异性针对猪水泡病病毒的引物及探针，分别设计多对特异性引物 及探针，经过前期试验筛选后选取灵敏度和特异性良好的引物及探针，优化反应条件和引 物探针应用浓度，旨在建立一种可以快速、灵敏、准确地检测我国猪水泡病病毒的荧光定量 RT-PCR方法，优化并组装成试剂盒。本专利技术在检测过程中将反转录和PCR扩增过程在一步 反应中完成，使得检测时间由原来的4-5小时缩短到现在的1-2小时，从而有利于快速检 测。本专利技术比普通PCR的灵敏度高，对模板浓度要求较低，可用于检测低微含量的猪水泡病 病毒；无需电泳就可直观的反应检测结果，避免了溴化乙锭对人体健康的危害；同时本发 明使用了探针法，只有探针引物特异的结合到扩增的靶序列上时才会产生有效的结果，荧 光定量可以看到整个扩增过程、扩增效率、溶解温度，而本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于检测猪水泡病病毒的Taqman Real‑time RT‑PCR试剂盒，所述试剂盒包含One Step RT‑PCR buffer、酶混合物、阳性对照、无RNA酶水、序列SEQ ID NO:1至 SEQ ID NO:2的引物及SEQ ID NO:3的探针引物的混合物，其特征在于所述序列SEQ ID NO:1至 SEQ ID NO:2的引物序列为：SEQ ID NO:1：上游引物CTCGCCGTTCGTTCTCGCATCC；SEQ ID NO:2：下游引物GACCGGGCAACACTCCTCATCACA。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：田宏，吴锦艳，尚佑军，陈妍，王光祥，郑海学，刘湘涛，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃;62
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