人工合成的水貂特异性的CpG ODN及其应用，涉及生物技术领域，本发明专利技术的目的是通过人工合成对水貂特异性的CpG ODN序列，作为增强水貂伪狂犬灭活疫苗的免疫保护效果的佐剂。本发明专利技术的人工合成的水貂特异性的CpG ODN，其序列为：5＇-atcgatcgatcgatagtcgttt-3＇，如SEQ ID NO:1所示。人工合成的水貂特异性的CpG ODN作为水貂伪狂犬灭活疫苗佐剂的应用。本发明专利技术人工合成的CpG ODN成本较低、效果好，可在GMP条件下大量生产而且相当经济，比较适合大规模的临床应用，可以更好更广泛的用于生产实践。本发明专利技术人工合成的CpG ODN对水貂外周血淋巴细胞刺激指数较高，本发明专利技术人工合成的水貂特异性的CpG ODN可有效增强伪狂犬灭活疫苗的免疫保护效果。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种人工合成的水貂特异性的CpGODN及其 应用。
技术介绍
CpG0DN(01igodeoxynucleotidescontainingCpGmotifs)是人工合成的含非甲 基化CpG基序的寡聚脱氧核苷酸，它能够模拟细菌DNA的免疫刺激活性，作为一种病原相关 分子模式（Pathogenassociatedmolecularpatterns，PAMP)与动物机体许多免疫细胞中 的模式识别受体（Patternrecognitionreceptors，PRR)TLR_9结合，刺激机体产生固有免 疫应答，有效增强树突状细胞、B细胞、单核细胞、巨噬细胞等免疫细胞的活性和促进多种细 胞因子的分泌，从而非特异性的增强适应性免疫应答的强度，在机体抵抗病原入侵和抗肿 瘤等方面起到免疫增强剂的作用。 CpG0DN在人用乙肝疫苗中已经通过了III期临床研究，还在其他很多人用疫苗 中也已经进入到II期、III期临床研究阶段，但在兽用疫苗中的应用还比较滞后。动物在 物种进化过程中，其TLR-9的基因也逐步在种间变异，不同种类的动物体内表达的TLR-9在 结构上存在一定的细微差异，使得这些TLR-9所识别的CpG0DN也不尽相同。CpG0DN是多 个脱氧核苷酸有规律的排列，其组合形式多样，而不同序列结构特征的CpG0DN免疫活性相 差很大，改变序列中的某一个或某几个核苷酸都可能会极大地影响其免疫活性。因此，CpG 0DN的免疫刺激活性具有种属特异性，具体表现为包含CpG核心的不同碱基序列可能针对 不同种属的动物有免疫刺激活性。 水貂伪狂犬病又称阿氏病，是由伪狂犬病病毒引起的多种动物共患的急性病毒性 传染病。病的特点是发热、脑脊髓炎和神经炎、皮肤骚痒。本病肉食毛皮动物和猪多发。预 防本病的发生，必须对饲料进行严格检查，特别是喂猪内脏等肉类饲料更要注意，应严格无 害处理后再喂动物。对本病进行特异性预防，应是注射疫苗。目前没有专门针对水貂伪狂 犬病的疫苗，多采用家畜伪狂犬疫苗进行预防接种。尽管目前研究人员已经设计筛选出许 多对多种动物有效的CpG0DN，但是还不能确定这些CpG0DN是否就是对该种动物是最有效 的，除了猪、牛、羊、鸡、犬、猫等常见畜禽，毛皮动物水紹、狐狸等的特异性CpGODN序列目前 还未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是通过人工合成对水貂特异性的CpG0DN序列，作为增强水貂伪狂 犬灭活疫苗的免疫保护效果的佐剂，提供一种人工合成的水貂特异性的CpG0DN及其应用。 本专利技术为解决技术问题所采用的技术方案如下： 本专利技术的人工合成的水貂特异性的CpG0DN，其序列为： 5 ' -atcgatcgatcgatagtcgttt-3 '，如SEQIDN0:1 所不。 本专利技术人工合成的水貂特异性的CpG0DN作为水貂伪狂犬灭活疫苗佐剂的应用。 本专利技术的有益效果是： 1、根据目前研究中表明的CpG0DN的免疫活性与其序列结构特点之间的关系，以 与水貂亲缘关系较近的犬最佳CpG基序ATCGAT、AACGTT为核心设计出多条CpG0DN序列， 涉及到CpG0DN序列中序列的长度、骨架修饰、CpG基序的位置数量、序列中回文结构的有 无等。与其他免疫佐剂相比，本专利技术人工合成的CpG0DN成本较低、效果好，可在GMP条件 下大量生产而且相当经济，比较适合大规模的临床应用，可以更好更广泛的用于生产实践。 2、本专利技术人工合成的水貂特异性的CpG0DN对水貂外周血淋巴细胞刺激指数较 高，接近刀豆蛋白（ConA)，且高于阳性对照CpG2006。测得A49Q0D值ConA、CpG2006和CpG-23 均明显高于阴性对照和空白对照（p< 0. 01)，ConA和CpG-23无明显差异，且均明显高于 CpG2006(p< 0. 05) 〇 3、本专利技术人工合成的水貂特异性的CpG0DN可作用于水貂外周血单个核细胞表现 出抗病毒活性。 4、本专利技术人工合成的水貂特异性的CpG0DN可有效增强伪狂犬灭活疫苗的免疫保 护效果。伪狂犬灭活疫苗与本专利技术人工合成的CpG0DN联合使用组免疫后14至28日中和 抗体水平明显高于疫苗单独免疫组和对照组，攻毒后对照组5/5发病，疫苗单独免疫组和 伪狂犬灭活疫苗配合20μgCpG-23组保护率为4/5,伪狂犬灭活疫苗配合40μg和80μg CpG-23组保护率均为5/5,说明本专利技术人工合成的CpG0DN能够增强伪狂犬灭活疫苗的免 疫保护效果。 5、本专利技术人工合成的水貂特异性的CpG0DN结构相对稳定且易长期保存，能够与 水剂或油乳化剂形式的各种疫苗一起使用，免疫途径广泛，可以通过口服、滴鼻和生殖道等 多种方式给药等。【附图说明】图1为本专利技术人工合成的水貂特异性的CpG0DN刺激水貂外周血单个核细胞增殖 (0D值）。图中，**表示差异极显著（P< 0· 01)。 图2为伪狂犬灭活疫苗免疫后中和抗体水平。【具体实施方式】 实施例1本专利技术人工合成的水貂特异性的CpG0DN的序列设计及制备 根据目前研究中表明的CpG0DN的免疫活性与其序列结构特点之间的关系，以与 水貂亲缘关系较近的犬最佳CpG基序ATCGAT、AACGTT为核心设计出多条CpG0DN序列，涉 及到CpG0DN序列中序列的长度、骨架修饰、CpG基序的位置数量、序列中回文结构的有无 等。所设计的CpG0DN序列见表1。表1 表1中的CpG-23序列即为本专利技术人工合成的CpG0DN序列。CpG0DN的人工合成 采用固相亚磷酰胺三脂法，合成过程如下： 材料： 三氯乙酸、可控多孔玻璃板、二甲氧基三苯甲基（DMT)、四氮唑活化剂、乙酸酐、 N-甲基咪唑、ABIDNA合成仪、高效液相色谱层析仪等。 A、T、C、G四种核苷酸单体：合成所用单体为核苷亚磷酰胺，是经过化学修饰的核 苷酸，含下面几个功能基团： ①3'位P上二异丙胺基，缩合所用的功能基。 ②3'位P上腈乙基，保护基，合成完毕后脱去。 ③5'-DMT保护基，缩合前脱去。 ④A和C的杂环氨基桑的苯甲酸保护基，合成完毕后脱去。 ⑤G上嘌呤环氨基上的异丙酰保护基，合成完毕后脱去。 反应步骤： 1、脱保护基 用三氯乙酸脱去连接在可控多孔玻璃板上的核苷酸的保护基团二甲氧基三苯甲 基（DMT)，获得游离的5 '-羟基端，以供下一步缩合反应。 2、活化 将亚磷酰胺保护的核苷酸单体与四氮唑活化剂混合并进入合成柱，形成亚磷酰胺 四唑活性中间体（其3'-端已被活化，但5'-端仍受DMT保护），此中间体将与可控多 孔玻璃板上的已脱保护基团的核苷酸发生缩合反应。 3、连接 亚磷酰胺四唑活性中间体遇到可控多孔玻璃板上已脱保护基的核苷酸时，将与其 5 羟基发生亲合反应，缩合并脱去四唑，此时合成的寡核苷酸链向前延长一个碱基。 4、封闭 缩合反应后为了防止连在可控多孔玻璃板上的未参与反应的5 羟基在随后的 循环反应中被延伸，常通过乙酰化来封闭此端羟基，一般乙酰化试剂是用乙酸酐和N-甲基 咪唑等混合形成的。 5、氧化 缩合反应时核苷酸单体是通过亚磷脂键与连在可控多孔玻璃板上的寡核苷酸链 接，而亚磷脂键不稳定，易被酸、碱水解，此时常用碘的四氢呋喃溶液将亚磷酰转化为磷酸 三脂本文档来自技高网...
【技术保护点】
人工合成的水貂特异性的CpG ODN，其特征在于，其序列为：5＇‑atcgatcgatcgatagtcgttt‑3＇，如SEQ ID NO:1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：冷雪，李真光，程世鹏，董鹏，胡桂学，杜锐，陈立志，王萃瑜，李云松，
申请(专利权)人：中国农业科学院特产研究所，
类型：发明
国别省市：吉林;22
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