本发明专利技术一般地涉及用于表征甲基化组的组合物和方法，所述甲基化组包括基因组的所有或基本上所有的甲基化状态。具体地，本文提供了多种寡核苷酸和使用本文所述的多种寡核苷酸的方法，每种寡核苷酸代表目标靶序列内的每个CG二核苷酸对的胞嘧啶位置的几乎每种可能的甲基化状态。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术一般地涉及用于表征甲基化组（methylome)的组合物和方法，所述甲基化 组包括基因组的所有或基本上所有的甲基化状态。具体地，本专利技术涉及多种寡核苷酸和使 用所述多种寡核苷酸鉴别目标靶核酸的每个CG二核苷酸对的胞嘧啶位置的甲基化状态的 方法。 专利技术背景 用于表征位于胞嘧啶-鸟嘌呤（CG)二核苷酸对中的鸟嘌呤附近的胞嘧啶的复制后甲 基化的黄金标准方案是亚硫酸氢盐转化并随后DNA测序。在目标核酸内的每个CG二核苷 酸对的胞嘧啶位置的甲基化状态将随分子的序列而变化，且可以表现出在〇%甲基化（即， 所有这样的胞嘧啶对亚硫酸氢盐处理敏感）和100%甲基化（即，这样的胞嘧啶都对亚硫酸 氢盐处理不敏感）之间的任何水平。因而，在真核基因组（例如，人基因组）中，巨大数目 的潜在甲基化状态可以是惊人的。为了鉴别基因组DNA样品中的所有甲基化占据，可与亚 硫酸氢盐转化的基因组DNA杂交的寡核苷酸的集合必须代表每个和每种潜在甲基化状态。 本领域中需要能够以单碱基分辨率、但是在全基因组规模表征DNA甲基化模式的 方法。还需要在全基因组规模鉴别甲基化占据的方法，其也能够将单核苷酸多态性与未甲 基化的碱基区分开。 专利技术概述 因而，本专利技术涉及多种可与靶生物的亚硫酸氢盐转化的基因组核酸样品的至少一部分 杂交的寡核苷酸，每种寡核苷酸在与靶生物的未转化的基因组核酸中的胞嘧啶-鸟嘌呤二 核苷酸对互补的二核苷酸对的每个位置处包含在每个胞嘧啶互补位置处的摆动碱基。使用 核苷三磷酸（dNTP)的等摩尔混合物，可以在寡核苷酸合成过程中掺入所述摆动碱基。然 后，dNTP的等摩尔混合物包含脱氧胞苷三磷酸（dCTP)和脱氧胸苷三磷酸（dTTP)。所述dNTP 的等摩尔混合物可能进一步包含脱氧腺苷三磷酸（dATP)、脱氧鸟苷三磷酸（dGTP)或脱氧 尿苷三磷酸（dUTP)。 在所述多种寡核苷酸内，每种寡核苷酸可能进一步包含在所述寡核苷酸的任一端 或两端处的连接序列。所述连接序列可能进一步包含在所述寡核苷酸的任一端或两端处的 生物素或荧光团。如本领域中已知的，也可以将多种寡核苷酸用支持物固定化。 在一个实施方案中，所述寡核苷酸的至少一个子集能够将胸腺嘧啶单核苷酸多态 性（SNP)与未转化的基因组核酸中的未甲基化的胞嘧啶区分开。 在第二方面，本专利技术提供了包含多个部件的杂交阵列，每个部件包含多种支持物 固定化的寡核苷酸，所述寡核苷酸可与靶生物的亚硫酸氢盐转化的基因组核酸样品的至少 一部分杂交，每种寡核苷酸在与靶生物的未转化的基因组核酸中的胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷 酸对互补的二核苷酸对的每个位置处包含在每个胞嘧啶互补位置处的摆动碱基。 对于这样的阵列，使用dNTP的等摩尔混合物，可以在寡核苷酸合成过程中掺入所 述摆动碱基。所述dNTP的等摩尔混合物可以包含脱氧胞苷三磷酸（dCTP)和脱氧胸苷三磷 酸（dTTP)。此外，所述dNTP的等摩尔混合物可能进一步包含脱氧腺苷三磷酸（dATP)、脱氧 鸟苷三磷酸（dGTP)或脱氧尿苷三磷酸（dUTP)。 在这样的阵列内，每种寡核苷酸可以进一步包含在所述寡核苷酸的任一端或两端 处的连接序列。所述连接序列可以包含在所述寡核苷酸的任一端或两端处的生物素或荧光 团。 在一个实施方案中，这样的阵列的至少一些寡核苷酸能够鉴别与靶生物的未转化 的基因组核酸中的胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸对互补的二核苷酸对的甲基化的碱基。具体 地，所述寡核苷酸的至少一个子集能够将胸腺嘧啶单核苷酸多态性（SNP)与未转化的基因 组核酸中的未甲基化的胞嘧啶区分开。 在第三方面，本专利技术涉及一种用于鉴别亚硫酸氢盐转化的靶核酸序列内的甲基化 的碱基的方法，所述方法包括下述步骤： (a) 使多种寡核苷酸与亚硫酸氢盐转化的核酸样品接触，每种寡核苷酸可与靶生物的 亚硫酸氢盐转化的基因组核酸样品的至少一部分杂交，且每种寡核苷酸在与靶生物的未转 化的基因组核酸中的胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸对互补的二核苷酸对的每个位置处包含在 每个胞嘧啶互补位置处的摆动碱基，其中所述接触会用所述多种寡核苷酸的至少一部分捕 获杂交复合物中的亚硫酸氢盐转化的靶核酸分子； (b) 使所述杂交复合物与未结合的和非特异性地结合的核酸分子分离； (c) 从所述杂交复合物洗脱捕获的亚硫酸氢盐转化的靶核酸分子； (d) 将洗脱的亚硫酸氢盐转化的靶核酸序列测序；和 (e) 鉴别洗脱的亚硫酸氢盐转化的靶核酸序列的甲基化的碱基，其中鉴别包括，将所 述靶生物的未转化的基因组核酸与所述洗脱的亚硫酸氢盐转化的靶核酸序列对比，其中如 果所述洗脱的亚硫酸氢盐转化的靶核酸序列中的对应位置是胸腺嘧啶，则将所述未转化的 基因组核酸的胞嘧啶鉴别为未甲基化的，且其中如果所述洗脱的亚硫酸氢盐转化的靶核酸 序列中的对应位置是胞嘧啶，则将所述未转化的基因组核酸的胞嘧啶鉴别为甲基化的。 使用dNTP的等摩尔混合物，可以在寡核苷酸合成过程中掺入所述摆动碱基。所述 dNTP的等摩尔混合物可以包含脱氧胞苷三磷酸（dCTP)和脱氧胸苷三磷酸（dTTP)，且也可 以进一步包含脱氧腺苷三磷酸（dATP)、脱氧鸟苷三磷酸（dGTP)或脱氧尿苷三磷酸（dUTP)。 根据本专利技术的方法可以进一步包括通过聚合酶链式反应扩增洗脱的亚硫酸氢盐 转化的靶核酸序列的步骤。 所述靶核酸序列经常是基因组DNA，但是在例外情况下，也可以是其它DNA或RNA。 所述接触步骤a)可以在有亚硫酸氢盐转化的COtl DNA存在下发生，以便避免非 特异性的假碱基配对。所述亚硫酸氢盐转化的COtl DNA和所述靶生物可以属于相同物种。 在一个实施方案中，每种寡核苷酸进一步包含在所述寡核苷酸的任一端或两端处 的连接序列。所述连接物质可以包含在所述寡核苷酸的任一端或两端处的标记诸如生物素 或荧光团。 此外，所述新方法可以包括将胸腺嘧啶单核苷酸多态性（SNP)与未转化的基因组 核酸中的未甲基化的胞嘧啶区分开的步骤。 专利技术详述 本专利技术涉及用于生物的全基因组的甲基化状态或生物的"甲基化组"的全基因组绘图 的方法和组合物。本专利技术至少部分地基于专利技术人的用于产生多种寡核苷酸的方法的发现， 每种寡核苷酸代表目标靶序列内的每个CG二核苷酸对的胞嘧啶位置的几乎每种可能的甲 基化状态。CG二核苷酸不均匀地分布在基因组中，而是集中在重复基因组序列区域中和 CpG "岛"中，它们通常与基因启动子有关。鉴于使用常规探针合成方案来得到多种足够广 泛以表征长亚硫酸氢盐转化的核酸样品（包括象真核基因组那么大的亚硫酸氢盐转化的核 酸样品）中的所有或几乎所有可能甲基化位点的寡核苷酸在技术上或在经济上尚不可行， 专利技术人的发现和本文提供的专利技术是特别重要的。 组合物 因此，在一个方面，本专利技术提供了多种寡核苷酸。在优选的实施方案中，所述多种寡核 苷当前第1页1 2 3 4 本文档来自技高网...
【技术保护点】
多种寡核苷酸，其可与靶生物的亚硫酸氢盐转化的基因组核酸样品的至少一部分杂交，每种寡核苷酸在与靶生物的未转化的基因组核酸中的胞嘧啶‑鸟嘌呤二核苷酸对互补的二核苷酸对的每个位置处包含在每个胞嘧啶互补位置处的摆动碱基。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：J杰德洛，D布格斯，
申请(专利权)人：豪夫迈·罗氏有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH
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