本发明专利技术提供了使用基于序列的分析和合理的策略来提高免疫结合剂，特别是单链抗体(scFv)的溶解性的方法。本发明专利技术提供了改造免疫结合剂，特别是scFv的方法，其中用通过分析选择的稳定scFv序列的数据库而鉴定的亲水性残基进行一个或多个置换。本发明专利技术还提供了根据本发明专利技术的改造方法制备的具有优化的溶解性的免疫结合剂。
【技术实现步骤摘要】
【专利说明】免疫结合剂的溶解性优化[00011 本申请是申请号为200980123815.6的分案申请。相关申请 本申请要求于2008年6月25日提交的、名称为"SolubilityOptimizationof Immunobinders" 的US61/075,692的优先权。专利技术背景已证明抗体在癌症、自身免疫疾病和其他病症的治疗中是非常有效和成功的治疗 剂。尽管一般已在临床上使用全长抗体，但存在使用抗体片段可以提供的许多优点，例如增 加组织穿透力、与增加其他效应子功能的能力结合的Fc效应子功能的不存在、和由较短的 全身体内半衰期导致的较少全身性副作用的可能性。抗体片段的药代动力学性质表明，它 们可能特别良好地适合于局部治疗方法。此外，抗体片段在特定表达系统中可以比全长抗 体更容易产生。 -个类型的抗体片段是单链抗体(scFv)，其由经由接头序列缀合的轻链可变结构 域(VL)与重链可变结构域(VH)组成。因此，scFv缺乏所有抗体恒定区结构域，并且先前的可 变/恒定结构域界面的氨基酸残基(界面残基)变成溶剂暴露的。scFv可以通过已建立的重 组改造技术由全长抗体(例如IgG分子)制备。然而，全长抗体转变成scFv通常导致蛋白质的 弱稳定性和溶解性、低产量和高聚集趋势，这增加免疫原性危险。 因此，已尝试改善scFv的性质例如溶解性。例如，Nieba，L.等人(Prot.Eng.(1997) 10:435-444)选择已知为界面残基的3个氨基酸残基且使其突变。他们观察到突变的scFv在 细菌中周质表达增加，以及热诱导聚集速率减小，尽管热力学稳定性和溶解性未显著改变。 此外，在他们的公开物中，他们明确地陈述，他们未观察到改造的scFv的天然蛋白质状态的 任何溶解性的提高，如通过PEG沉淀法所测定的。其中对scFv内的特定氨基酸残基进行定点 诱变的其他研究也已得到报告（参见例如，Tan，P.H.等人（1988)Biophys.J. 75:1473-1482; Worn，A.和Pluckthun，A.(1998)Biochem.37:13120-13127;Worn，A.和Pluckthun，A.(1999) Biochem. 38:8739-8750)。在这些各种研究中，选择用于诱变的氨基酸残基基于其在scFv结 构内的已知位置(例如，来自分子建模研究)进行选择。在另一种方法中，将来自表达极弱的scFv的互补决定区（CDR)移植到已证实具有 有利性质的scFv的构架区内（Jung，S·和Pluckthun，A· (1997)Prot·Eng· 10:959-966)。所得 到的scFv显示改善的可溶性表达和热力学稳定性。 改造scFv以改善溶解性和其他功能性质中的进展在例如Worn，A.和Pluckthun，A. (2001)J.Mol.Bio1.305 :989-1010中综述。然而，仍需要允许合理设计免疫结合剂 (immunobinder)，特别是具有优良溶解性的scFv的新方法。此外，仍需要改造scFv和其他类 型的抗体从而赋予改善的溶解性一尤其是天然蛋白质的溶解性的方法。 专利技术概述本专利技术提供了在可变重链区VH中包含溶解性增强基序的免疫结合剂以及改造免 疫结合剂例如scFv抗体以赋予改善的溶解性的方法。在特定的实施方案中，本专利技术的方法 包括用赋予改善的溶解性的优选氨基酸残基置换免疫结合剂的重链可变区和/或轻链可变 区的序列内的对于溶解性潜在有问题的氨基酸。例如，在某些优选实施方案中，用亲水性残 基置换疏水性残基。 优选地，提供的免疫结合剂，在本专利技术的改造方法中使用的或由本专利技术的改造方 法产生的免疫结合剂是scFv，但其他免疫结合剂例如全长免疫球蛋白、Fab片段、单结构域 抗体(例如Dab)和纳米抗体(Nanobody)也可以根据所述方法进行改造。本专利技术还包括根据 改造方法制备的免疫结合剂，以及包含所述免疫结合剂和药学上可接受的载体的组合物。在一个方面，本专利技术提供了免疫结合剂，所述免疫结合剂在重链氨基酸位置12、 103和144(AHo编号）中包含下列溶解性增强基序之一： (a)重链氨基酸位置12处的丝氨酸(S); (b)重链氨基酸位置103处的丝氨酸(S);和 (C)重链氨基酸位置144处的苏氨酸(T);或 (al)重链氨基酸位置12处的丝氨酸(S); (bl)重链氨基酸位置103处的苏氨酸(T);和 (cl)重链氨基酸位置144处的丝氨酸(S);或 (a2)重链氨基酸位置12处的丝氨酸(S); (b2)重链氨基酸位置103处的苏氨酸(T);和 (c2)重链氨基酸位置144处的苏氨酸(T);或 (a3)重链氨基酸位置12处的丝氨酸(S); (b3)重链氨基酸位置103处的丝氨酸(S);和 (c3)重链氨基酸位置144处的丝氨酸(S)。在另一个方面，本专利技术提供了改造免疫结合剂的方法，免疫结合剂包含（i)重链可 变区或其片段，其中重链可变区包含Vh构架残基和/或（ii)轻链可变区或其片段，其中轻链 可变区包含I构架残基，所述方法包括：A)选择VH构架残基、VL构架残基或VH和VL构架残基中的至少两个氨基酸位置以用 于突变;和 B)突变选择用于突变的所述至少两个氨基酸位置，其中，如果选择用于突变的所述至少两个氨基酸位置在VH构架残基中，那么置换 在选自12、103和144(根据AHo编号约定)的一个或多个重链氨基酸位置上，和/或其中，如果选择用于突变的一个或多个氨基酸位置在I构架残基中，那么置换在 选自15、52和147(根据AHo编号约定;在使用Kabat编号的情况下，氨基酸位置15、44和106) 的轻链氨基酸位置上。在下文中进一步详细描述选择用于突变的所述至少两个氨基酸位置以及在选择 的位置处插入的氨基酸残基。下文中所示的氨基酸位置编号使用AHo编号系统;使用Kabat 编号系统的相应位置在本文中进一步描述，并且AHo和Kabat编号系统的转换表在下文的发 明详述中阐述。使用标准单字母缩写代码阐述氨基酸残基。令人惊讶地发现，在指定的位置上指定的突变的存在增加了免疫结合剂的总体溶 解性而不对蛋白质的其他功能性质产生负面影响。例如，在scFv的VH中3个增强溶解性的突 变V12S、L144S和V103T组合的情况下，发现所述置换占整个scFv的溶解性的约60%。这与现 有技术中陈述的增加免疫结合剂的表达产量的尝试不同。例如，US6，815，540描述通过减少 链内结构域间界面区域中的疏水性对免疫结合剂进行改进。为了所述目的，鉴定了重链可 变构架中的16个位置，所述位置可单独地用选自10个氨基酸的一个或多个氨基酸置换。发 现产生的突变体的表达产量增加。此外，相同的研究组于1999年，即所提及的美国专利的优 先权日期后3年，发表了论文（参见几1^，3.，!1〇1168861'，4.和？111〇1^1:111111，4.(1997) Prot.Eng. 10 :959-966)，该论文陈述，已在几个研究中报导用更加亲水的残基置换疏水性 表面残基提高了产量。根据该作者，产量的增加归因于正确折叠与错误折叠材料的聚集之 间的改善的动力学分配，同时天然蛋白质的溶解性不受影响，其热力学稳定性也未受到显 著影本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种免疫结合剂，其中所述免疫结合剂为scFv抗体、Dab或纳米抗体，并且包含重链氨基酸位置12、103和144(AHo编号)中的下列溶解性增强基序之一:(a)重链氨基酸位置12处的丝氨酸(S)；(b)重链氨基酸位置103处的丝氨酸(S)；和(c)重链氨基酸位置144处的苏氨酸(T)；或(a1)重链氨基酸位置12处的丝氨酸(S)；(b1)重链氨基酸位置103的苏氨酸(T)；和(c1)重链氨基酸位置144处的丝氨酸(S)；或(a2)重链氨基酸位置12处的丝氨酸(S)；(b2)重链氨基酸位置103处的苏氨酸(T)；和(c2)重链氨基酸位置144处的苏氨酸(T)。
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：L·波拉斯，D·厄里什，
申请(专利权)人：艾斯巴技术诺华有限责任公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。