一种通过不同宿主交替繁殖快速获得杀虫谱扩大重组昆虫病毒的方法技术

本发明专利技术公开了一种快速获得宿主域扩大重组昆虫病毒的方法。现有空斑纯化法和活体克隆法在筛选宿主域扩大重组病毒时，需借助于大量生物测定才能筛选出目的重组病毒，较为费时费力。针对这一问题，用分别对两种昆虫宿主专化的不同核型多角体病毒以高剂量共同侵染其中一种宿主群体，繁殖后再以极低剂量侵染另一种宿主，单头收集染病害虫，所获得的单头病毒即为能够同时感染两种宿主的宿主域扩大重组病毒。同现有技术相比，本方法明显提高了目的病毒的获得速度，有效地扩大了病毒的宿主域范围，从而扩大了病毒的应用范围。

【技术实现步骤摘要】
一、
本专利技术属于害虫生物防治
，具体涉及一种通过在不同活体宿主中交替繁殖快速获得杀虫谱扩大重组病毒的方法。二、技术背景昆虫病毒杀虫剂因具有对靶标害虫致病性高和能在害虫种群中自然传播并长期流行，以及不易产生抗药性等优于其它杀虫剂的特点，一直以来都受到人们关注。然而单一的病毒杀虫剂除存在杀虫速度慢的缺点，还有杀虫谱窄的不足，这些均束缚了昆虫病毒在生产上的应用。如何通过有效的生物学途径，扩大病毒的宿主域，此对于创新和高效利用昆虫病毒防治重大害虫至关重要。现已研究证实，在昆虫细胞或活体内，利用异源重组的方法可成功得到宿主域较亲本病毒扩大的重组病毒株系。如苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)和刺金翅夜蛾核型多角体病毒(RoNPV)共同感染大蜡螟幼虫时，可得到不同于两个亲本的重组病毒(Crozier等，1988)；用AcNPV与家蚕核型多角体病毒(BmNPV)共同感染Sf-21细胞(BmNPV的非受纳细胞系)，获得了能在Sf-21和家蚕细胞系中均可复制增殖的重组病毒，其宿主域得到扩大(Kondo等，1991年)；将斜纹夜蛾核型多角体病毒(SlNPV)病毒粒子与甜菜夜蛾核型多角体病毒(SeNPV)DNA的BamHI酶切片段，以及SeNPV病毒粒子与SlNPVDNA的BamHI的酶切片段共转染，均获得了寄主范围扩大的重组病毒(刘彦文等，1996)。空斑纯化法和活体克隆法都可用于分离重组昆虫病毒，其中空斑纯化法为通过在细胞中培养来分离病毒不同基因型，为常用分离方法，而活体克隆法则利用活体昆虫宿主来分离病毒不同基因型，应用相对较少。虽然空斑纯化法能较快速地分离出许多病毒基因型，但要明确各病毒基因型对活体宿主的致病力，筛选出目的重组病毒，还需要对分离的多个病毒基因型进行大量生物测定，通过活性测定结果明确病毒活性和宿主域。传统的活体克隆法利用一种活体宿主分离病毒基因型，其分离获得的病毒基因型对克隆宿主有致病力，但对其他活体宿主是否有致病力，需要借助于生物测定来明确。因此，在不同病毒发生重组后，要分离宿主域扩大的重组病毒，无论是现有的空斑纯化法还是活体克隆法，均需要借助于大量生测才能筛选出目的重组病毒。要有效提升昆虫病毒作为病毒杀虫剂的潜力，需要建立一种快速获得宿主域扩大重组昆虫病毒的方法。三、
技术实现思路
1、专利技术目的提供一种快速的宿主域扩大重组昆虫病毒获得方法，能有效筛选宿主域扩大病毒，提升病毒杀虫剂的应用潜力。2、技术方案为达到上述目的，本专利技术选用分别对两种昆虫宿主专化的不同核型多角体病毒以高剂量共同侵染其中一种宿主群体，繁殖后再以极低剂量侵染另一种宿主，单头收集染病害虫，所获得的单头病毒即为能够同时感染两种宿主的宿主域扩大重组病毒。本专利技术为一种宿主域扩大的重组昆虫病毒的获得方法，其特征在于利用不同活体宿主交替繁殖快速获得杀虫谱扩大的重组病毒，提升昆虫病毒的应用潜力。3、有益效果本专利技术的方法与现有技术相比，产生以下有益效果：(1)与传统的空斑纯化法和活体克隆法相比，明显提高了目的重组病毒筛选速度。(2)有效地扩大了病毒的宿主域范围，从而扩大了病毒应用范围。(3)显著减少了施药次数，降低了病毒的应用成本。四、具体实施方式：本专利技术的实施例是采用室内生物测定方法。供试材料供试昆虫：斜纹夜蛾和甜菜夜蛾均为室内长期人工饲养，已连续饲养40多代。饲养温度为27℃+1℃，光照为14h：10h(L：D)，虫卵用2％甲醛消毒，幼虫3龄前群体饲养，3龄后单头饲养。试验选用龄期一致的健康幼虫。供试病毒：SlNPV、SeNPV和AcNPV均为本实验室长期保存。病毒纯化后适当稀释，用血球计数板计数，4℃冰箱保存备用。试验方法病毒侵染和分离：将不能经口感染斜纹夜蛾的SeNPV或者AcNPV与不能经口感染甜菜夜蛾的SlNPV按多角体浓度1∶1以高浓度(108PIB/ml)混合感染甜菜夜蛾幼虫，饲料添毒法，感染致死后收获病虫，进行病毒多角体纯化。再将纯化后的多角体以10PIB/头的低剂量感染斜纹夜蛾4龄初期幼虫，共接种100-300头斜纹夜蛾，放于6孔板中，每孔1头，在病毒致死率在5％以下时，收集单头病虫，并分别纯化，测定其中病毒产量最高的单头病毒的活性，同时以重组前的SlNPV作为对照。病毒活性测定：采用饲料添毒法测定病毒对斜纹夜蛾和甜菜夜蛾幼虫的活性，分别测定浓度为107PIB/ml、108PIB/ml和109PIB/ml病毒的活性。将人工饲料切成相同小块(确保24h内吃完)，加入灭过菌的24孔板中，加10μl病毒悬浮液。SeNPV和SlNPV复合侵染处理组分别接入大小一致甜菜夜蛾或斜纹夜蛾3龄中期幼虫，AcNPV和SlNPV复合侵染处理组分别接入大小一致甜菜夜蛾2龄中期幼虫或斜纹夜蛾3龄中期幼虫，每孔1头，每个浓度处理4块板，同时以清水作为空白对照。试验在29+1℃培养箱中培养，每日调查病死虫数，直到不再有病毒致死幼虫出现。实施例1将不能感染斜纹夜蛾的SeNPV和不能感染甜菜夜蛾的SlNPV按病毒多角体数量1：1混合以高浓度一同感染甜菜夜蛾后，获得病毒再经低剂量感染斜纹夜蛾，获得了对斜纹夜蛾和甜菜夜蛾均有活性的重组病毒。毒力测定结果表明，在病毒浓度为108PIB/ml和109PIB/ml时，较重组前的SlNPV而言，重组病毒对甜菜夜蛾3龄幼虫的致死率由重组前的0％分别上升到20.5％和31.6％。同时，病毒对斜纹夜蛾3龄幼虫的致死率分别为89.2％和98.5％与重组前的92.8％和99.6％无显著差异。实施例2同样，将不能感染斜纹夜蛾的AcNPV和不能感染甜菜夜蛾的SlNPV按病毒多角体数量1∶1混合以高浓度一同感染甜菜夜蛾后，获得病毒再经低剂量感染斜纹夜蛾，也获得了对斜纹夜蛾和甜菜夜蛾均有活性的重组病毒。活性测定结果表明，病毒浓度为107PIB/ml时，对甜菜夜蛾2龄幼虫的致死率由重组前的0上升至22.8％。病毒浓度为108PIB/ml和109PIB/ml时，对斜纹夜蛾3龄幼虫的致死率没有显著变化，分别为87.4％和97.0％，与重组前的92.8％和99.6％无显著差异。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种杀虫谱扩大重组昆虫病毒的获得方法，其特征在于通过在不同宿主中交替繁殖快速获得杀虫谱扩大重组昆虫病毒。

【技术特征摘要】
1.一种杀虫谱扩大重组昆虫病毒的获得方法，其特征在于通过在

【专利技术属性】
技术研发人员：郭慧芳，方继朝，刘宝生，钟万芳，张志春，牛洪涛，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32