香菇L808菌种的EST-SSR标记引物及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种香菇L808菌种的EST-SSR标记引物及其应用，所述标记引物由名称为Le808-1，Le808-2、Le808-3、Le808-4、Le808-5、Le808-6的6对SSR引物中至少一对构成；其应用步骤如下：（1）菌丝固体培养、（2）基因组DNA的提取、（3）SSR分子标记的检测、（4）电泳检测、（5）菌种鉴定。本发明专利技术提供的标记与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短，准确性高，重复性好的优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及香菇L808菌种的检测鉴定领域，具体为一种香菇L808菌种的EST-SSR标记及其应用。
技术介绍
香菇(Lentinulaedodes)隶属于担子菌纲、伞菌目、口蘑科、香菇属。冬春季生于阔叶树倒木上，是白腐菌中的一种重要的大型食用真菌之一。作为世界第二大食用菌，香菇的栽培已有800年以上的历史。近几十年来，香菇的栽培模式不断发展。香菇作为一种食用菌，是当今市场上不可多得的天然保健食品之一。香菇蛋白质含量高，氨基酸种类丰富，内含的香菇多糖具有抗癌功能，经常食用具有预防高血压、治疗肝病和胃溃疡等功效。香菇已被日本和美国列入药典。香菇是仅次于双孢蘑菇产量的世界第二大菇类，近几年我国香菇年干菇产量达到9万吨(约90万吨鲜菇)，稳居世界第一的位置。尽管近几年我国香菇产量位居世界第一，但是相较与日本，日本香菇的品质上乘且价格昂贵，而我国产量大，却在品质上有更进一步提高的空间。因此对于我国未来的香菇生产来说，选育优质的香菇品种有着重要的意义。优质菌种在香菇单产和质量中的贡献率举足轻重，这决定了菌种在香菇产业中的重要地位。1999年我国签署了《国际植物新品种保护法》，这不仅要求我们尊重其它国家的品种知识产权，同时也要加强保护我们国家自己的品种知识产权，为了建立食用菌新品种登记制度来真正保护我国的品种产权，必须首先建立成熟的品种鉴定技术，为进一步的新品种登记奠定基础。2004年4月1日本开始实行《种苗法修正案》，对我国食用菌的生产构成了极大的威胁。就国内而言，食用菌栽培菌种“同种异名，异种同名”的现象普遍存在，这不仅不利于农户针对特定品种进行科学化管理，甚至可能因为某些选用了性状不佳的菌种带来较低的经济效益，从而影响了农户栽培香菇的积极性，极大地制约了香菇产业的可持续发展；随着社会的进步和人们消费水平的提高，消费者对香菇的质量的要求越来越高，这对香菇生产来说提出了更高的要求。为了确保菌株的品质，发展简便、快速和准确的菌株鉴定技术，力求保证农户高收益和消费者吃到高品质的成品香菇是中国未来香菇产业的必由之路。面对这种局势，就需要我们进一步加快菌种鉴定技术的研究，在香菇的研究中建立更为有效的菌种鉴定体系。“L808”是2007年由丽水市大山菇业研究开发有限公司，以菇形、菇质优，提高秋栽香菇品质为选育目标,采用自然选育方法选育成功的香菇新品种。“L808”菌丝粗壮浓白,抗逆性强,适应性广,具有优异、稳定的遗传特性。子实体菇型大、朵形圆整、菌柄短、菌肉厚，商品性较好(808单菇重23.5±4.2g,盖径65.5±10.4mm,菇盖厚15±3.6mm,柄长44±8.6mm,柄粗28±5.6mm)；出菇温度10-28℃，菌龄120天，接种季节8-9月(早秋)，抗杂菌能力强，产量高，是秋栽新品种。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术提供了一种香菇L808菌种的EST-SSR标记及其构建方法与应用。该标记与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短，准确性高，重复性好的优点。所述标记引物由如名称为Le808-1，Le808-2、Le808-3、Le808-4、Le808-5、Le808-6的6对SSR引物中至少一对构成；所述6对引物的正反核苷酸序列如下：Le808-1:5′-ACCGGCATCTCTACCCTCAT-3′，5′-AGAGGATTCGGAGCAGGAGT-3′；Le808-2：5′-AGAGGACAATAGCGCGAGTG-3′，5′-GAGCTGTCGATGATGGTCGT-3′；Le808-3：5′-CAACCACGAGAAGGCGTAGT-3′，5′-GCATGGGTATGATTCGGGGT-3′；Le808-4：5′-TCGGGAAAAGTACCTTGCGG-3′，5′-TTACTGTCTTCGCTTGCGGT-3′；Le808-5：5′-TGCTCGGATCCTTCATTCCC-3′，5′-TTGATGACGCACCAGAGGAC-3′；Le808-6：5′-GGTGCAACTAGGGTAGGTCG-3′，5′-TCGTACTGTCGAGGTGAGGT-3′。香菇L808菌种的EST-SSR标记引物在菌种检测鉴定中的应用。“L808”是2007年由丽水市大山菇业研究开发有限公司，以菇形、菇质优，提高秋栽香菇品质为选育目标,采用自然选育方法选育成功的香菇新品种。“L808”菌丝粗壮浓白,抗逆性强,适应性广,具有优异、稳定的遗传特性。子实体菇型大、朵形圆整、菌柄短、菌肉厚，商品性较好(808单菇重23.5±4.2g,盖径65.5±10.4mm,菇盖厚15±3.6mm,柄长44±8.6mm,柄粗28±5.6mm)；出菇温度10-28℃，菌龄120天，接种季节8-9月(早秋)，抗杂菌能力强，产量高，是秋栽新品种。香菇L808菌种的EST-SSR标记引物在菌种检测鉴定中的应用，步骤如下：（1）菌丝固体培养：将香菇菌种转接到覆盖玻璃纸的马铃薯葡萄糖固体培养基中，20℃~25℃下培养，7-10d后收集菌丝；（2）基因组DNA的提取：用CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）法提取上述菌丝的基因组DNA，紫外分光光度法和凝胶电泳两种方法检测总基因组DNA浓度和纯度，尽可能调整样品DNA的浓度一致；（3）SSR分子标记的检测：对上述提取的DNA进行基因SSR标记的PCR扩增；PCR扩增体系为：总体积20μL，包括：10×PCRbuffer2μL，25mmol/LMgCl22μL，10mmol/LdNTP0.4μL，5U/μLTaqDNA酶0.2μL，10μmol/LSSR标记正/反向引物总体积1.5μL，浓度20-30ng/μLDNA模板2μL，ddH2O10.4μL；PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30seconds，55-60℃退火30seconds，72℃延伸30seconds，共进行35个循环；最后进行72℃延伸5min；（4）电泳检测：将上述PCR扩增得到的产物与5μL加样缓冲液混匀，点样3.5μL于非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，非变性聚丙烯酰胺凝胶的体积百分比浓度为10%，电泳缓冲液为1×TBE，电压150v，电流200mA，功率200W，电泳45min，银染，显色，拍照，分析结果；采用6对EST-SSR引物对金针菇菌株进行PCR扩增，通过对照markerI可确定各SSR引物扩增的等位片段的数量和相对分子量，找到符合编号组合为：1(1+2+3)(1+2+3)(1+2+3+4)(1+2+3+4）(1+2)的菌种，即可确定该菌种为香菇菌种L808，如图1中箭头标注所示。上述步骤（2）中CTAB法提取菌丝的基因组DNA工艺包括：①将液氮冷冻干燥的金针菇菌丝研磨成粉末，加入65℃预热的2×CTAB抽提液，于65℃保温45-60min，间或轻摇混匀；②12000rpm、4℃离心20min，取上清液；③在上述上清液中加入等体积酚氯仿异戊醇的混合液（体积比为25：24本文档来自技高网...

【技术保护点】
香菇L808菌种的EST‑SSR标记引物， 其特征在于，所述标记引物由名称为Le808‑1，Le808‑2、Le808‑3、Le808‑4、Le808‑5、Le808‑6的6对SSR引物中至少一对构成；所述6对引物的正反核苷酸序列如下：Le808‑1: 5′‑ ACCGGCATCTCTACCCTCAT‑3′， 5′‑AGAGGATTCGGAGCAGGAGT‑3′；Le808‑2：5′‑ AGAGGACAATAGCGCGAGTG ‑3′，5′‑ GAGCTGTCGATGATGGTCGT ‑3′；Le808‑3：5′‑ CAACCACGAGAAGGCGTAGT ‑3′，5′‑ GCATGGGTATGATTCGGGGT ‑3′；Le808‑4：5′‑ TCGGGAAAAGTACCTTGCGG ‑3′，5′‑ TTACTGTCTTCGCTTGCGGT ‑3′；Le808‑5：5′‑ TGCTCGGATCCTTCATTCCC ‑3′，5′‑ TTGATGACGCACCAGAGGAC ‑3′；Le808‑6：5′‑ GGTGCAACTAGGGTAGGTCG ‑3′，5′‑ TCGTACTGTCGAGGTGAGGT ‑3′。...

【技术特征摘要】
1.香菇L808菌种的EST-SSR标记引物，其特征在于，所述标记引物由名称为Le808-1，Le808-2、Le808-3、Le808-4、Le808-5、Le808-6的6对SSR引物中至少一对构成；所述6对引物的正反核苷酸序列如下：
Le808-1:5′-ACCGGCATCTCTACCCTCAT-3′，5′-AGAGGATTCGGAGCAGGAGT-3′；
Le808-2：5′-AGAGGACAATAGCGCGAGTG-3′，5′-GAGCTGTCGATGATGGTCGT-3′；
Le808-3：5′-CAACCACGAGAAGGCGTAGT-3′，5′-GCATGGGTATGATTCGGGGT-3′；
Le808-4：5′-TCGGGAAAAGTACCTTGCGG-3′，5′-TTACTGTCTTCGCTTGCGGT-3′；
Le808-5：5′-TGCTCGGATCCTTCATTCCC-3′，5′-TTGATGACGCACCAGAGGAC-3′；
Le808-6：5′-GGTGCAACTAGGGTAGGTCG-3′，5′-TCGTACTGTCGAGGTGAGGT-3′。
2.如权利要求1所述的香菇L808菌种的EST-SSR标记引物在菌种检测鉴定中的应用。
3.如权利要求2所述的应用的，其特征在于，步骤如下：
（1）菌丝固体培养：将香菇菌种转接到覆盖玻璃纸的马铃薯葡萄糖固体培养基中，20℃~25℃下培养，7-10d后收集菌丝；
（2）基因组DNA的提取：用CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）法提取上述菌丝的基因组DNA，紫外分光光度法和凝胶电泳两种方法检测总基因组DNA浓度和纯度，尽可能调整样品DNA的浓度一致；
（3）SSR分子标记的检测：对上述提取的DNA进行基因SSR标记的PCR扩增；
PCR扩增体系为：总体积20μL，包括：10×PCRbuffer2μL，25mmol/LMgCl22μL，10mmol/LdNTP0.4μL，5U/μLTaqDNA酶0.2μL，10μmol/LSSR标记正/反向引物总体积1.5μL，浓度20-30ng/μLDNA模板2μL，ddH2O10.4μL；
PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30seconds，55-60℃退火30seconds，72℃延伸30seconds，共进行35个循环；最后进行72℃延伸5min；
（4）电泳检测：将上述PCR扩增得...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋婷婷，蔡为明，沈颖越，金群力，范丽军，冯伟林，李良英，
申请(专利权)人：浙江省农业科学院，
类型：发明
国别省市：浙江;33