转基因枸杞毛状根、基因转化方法及液体培养方法技术

本发明专利技术公开了一种转基因枸杞毛状根、基因转化方法及液体培养方法，转基因枸杞毛状根的基因转化方法，包括以下步骤：(1)制备枸杞无菌叶片；(2)发根农杆菌A4活化；(3)侵染外植体、共培养；(4)发根培养；(5)荧光检测；检测步骤(4)获得的毛状根中的RFP基因的红色荧光的存在与否；具有红色荧光的毛状根即为转基因枸杞毛状根。本发明专利技术通过发根农杆菌介导的转基因技术，可在短时间内得到毛状根，节约研究时间，并且转化效率较高，可达60％～70％左右。在液体培养基中枸杞毛状根可以大量的繁殖生长，解决了取材的问题，且易于观察生长情况。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，涉及植物转基因技术，主要涉及一种基于发根农杆菌介导的枸杞发状根转化及液体培养方法。
技术介绍
枸杞(LyciumchinenseMiller)是名贵的药材和滋补品，枸杞皮又称地骨皮，是枸杞的根皮，可入药，具有凉血、清肺降火等功效。目前在国内，对枸杞的研究多集中于地上部分的生理生化水平，而在地下组织的基因挖掘与功能分析的报道较少；特别是对枸杞的根系研究更是少之又少。对于枸杞关键生物学性状的研究，基因挖掘与功能验证起着不可或缺的作用，而在中国枸杞中，基于根系的转基因体系还未建立，其根系相关的基因功能还未见报道。目前缺少一套能让枸杞通过根系的转基因来验证类胡萝卜素相关基因的功能及其分析。发根农杆菌为革兰氏阴性细菌，采用Ri质粒侵染植物伤口进入细胞，并在其上含有的一段T-DNA插入到植物基因组中；发根农杆菌的Ri质粒的T-DNA有rosA-D基因群，T-DNA有tms基因，能诱发被感染的植物的受伤部位产生大量的毛状根，且Ri质粒T-DNA上的基因不影响植株的再生，转化效率高，目前已在甘草、烟草等中获得成功。发根农杆菌诱导的毛状根属于激素自养型，具有有效成分含量高、生理生化和遗传性稳定、易于进行操作控制等特点，且所诱导的毛状根可从形态水平上鉴定，根多丛生、多分枝、多根毛，且无向地性，这些都可与未转化的根区别开。在土壤中获取枸杞根面临着诸多问题，如果使枸杞的毛状根的数量增多，为获得大量的枸杞根有效成分提供保障，但目前，采用发根农杆菌在枸杞根系部分的转化及培养方法尚未报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种转基因枸杞毛状根。本专利技术的第二个目的是提供一种转基因枸杞毛状根的基因转化方法。本专利技术的第三个目的是提供一种转基因枸杞毛状根的液体培养方法。本专利技术的技术方案概述如下：一种转基因枸杞毛状根的基因转化方法，包括以下步骤：(1)制备枸杞无菌叶片：将枸杞叶片，清水冲洗干净后用无水乙醇擦拭表面，用乙醇水溶液消毒灭菌5-10min，灭菌蒸馏水漂洗3-5次，接种于MS培养基上，25℃暗共培养获得枸杞无菌叶片；(2)发根农杆菌A4活化：将发根农杆菌A4在含抗生素的LB固体培养基上划线，28℃暗处倒置培养36-48h后获得单菌落，挑取单菌落于含抗生素的LB液体培养基上，28℃、摇床转速180-220rpm暗培养36-48h，得到活化发根农杆菌A4；所述发根农杆菌A4的载体上含有35S:RFP基因；所述RFP基因用SEQ.ID.NO1所示；(3)侵染外植体、共培养：将活化发根农杆菌A4涂抹在划口后的枸杞无菌叶片的伤口处，放在共培养基上，在24℃～25℃，光照16h、暗培养8h，培养4-6d；(4)发根培养：将步骤(3)获得的枸杞叶片更换到发根培养基上，封口膜封好，24℃～25℃，光照16h，暗培养8h，培养25-30d，每6-8天更换一次发根培养基；(5)荧光检测；检测步骤(4)获得的毛状根中的RFP基因的红色荧光的存在与否；具有红色荧光的毛状根即为转基因枸杞毛状根。上述方法获得的转基因枸杞毛状根。上述转基因枸杞毛状根的液体培养方法，包括如下步骤：(1)配制含植物激素的液体培养基：向1/2MS液体培养基中加入植物激素IBA使浓度为0.1-0.5mg/L，混合均匀；(2)将转基因枸杞毛状根在步骤(1)获得的含植物激素的液体培养基中，24-28℃，转速80-120rpm，培养；15-20天更换一次步骤(1)获得的含植物激素的液体培养基，对转基因枸杞毛状根进行扩大培养。含抗生素的LB固体培养基是用下述方法制成：在LB固体培养基配方中加入卡那霉素，使卡那霉素的终浓度为80-120mg/L，加入壮观霉素，使壮观霉素的终浓度为80-120mg/L。含抗生素的LB液体培养基是用下述方法制成：在LB液体培养基配方中加入卡那霉素，使卡那霉素的终浓度为80-120mg/L，加入壮观霉素，使壮观霉素的终浓度为80-120mg/L。优点：本专利技术通过发根农杆菌介导的转基因技术，可在短时间内得到毛状根，节约研究时间，并且转化效率较高，可达60％～70％左右。在液体培养基中枸杞毛状根可以大量的繁殖生长，解决了取材的问题，且易于观察生长情况。附图说明图1为转基因枸杞毛状根照片。图2为转基因枸杞毛状根荧光检测结果照片。图3为转基因枸杞毛状根液体培养照片。具体实施方法下面结合具体实施例，对本专利技术作进一步的说明。RFP基因用SEQ.ID.NO1所示，RFP基因(GenBank:AF506027.1)发根农杆菌A4购买于NTCC典型培养物保藏中心(http://www.biovector.net/)，购买时间2014年9月。本专利技术采用的枸杞树河北枸杞树(商品化树)；新疆枸杞(商品化树)宁夏枸杞(商品化树)LB液体培养基的配方：1％蛋白胨+0.5％酵母提取物+1％Nacl；LB固体培养基的配方：1％蛋白胨+0.5％酵母提取物+1％Nacl+1.5％琼脂；MS培养基:将MS基本培养基粉末+1％琼脂共培养培养基：MS+3％蔗糖+0.7％琼脂发根培养基：MS+IBA0.2mg/L。实施例1一种转基因河北枸杞毛状根的基因转化方法，包括以下步骤：(1)制备河北枸杞无菌叶片：将新鲜的长势较好的河北枸杞叶片，清水冲洗干净后用无水乙醇擦拭表面，用体积浓度为73％的乙醇水溶液消毒灭菌8min，灭菌蒸馏水漂洗4次，接种于MS培养基上，25℃暗共培养获得河北枸杞无菌叶片；(2)发根农杆菌A4活化：将发根农杆菌A4在含抗生素的LB固体培养基上划线，28℃暗处倒置培养42h后获得单菌落，挑取单菌落于含抗生素的LB液体培养基上，28℃、摇床转速200rpm暗培养42h，得到活化发根农杆菌A4；所述发根农杆菌A4的载体上含有35S:RFP基因；所述RFP基因用SEQ.ID.NO1所示；(3)侵染外植体、共培养：将活化发根农杆菌A4涂抹在划口后的河北枸杞无菌叶片的伤口处，放在共培养基上，在25℃，光照16h、暗培养8h，培养5d；(4)发根培养：将步骤(3)获得的河北枸杞叶片更换到发根培养基上，封口膜封好，25℃，光照16h，暗培养8h，培养28d，每7天更换一次发根培养基；(5)荧光检测；利用荧光显微镜检测步骤(4)获得的毛状根中的RFP基因的红色荧光的存在与否；结果表明转入带有35S:RFP报告基因的植株根系可见整条根均有较强红色荧光即为...

【技术保护点】
一种转基因枸杞毛状根的基因转化方法，其特征是包括以下步骤：(1)制备枸杞无菌叶片：将枸杞叶片，清水冲洗干净后用无水乙醇擦拭表面，用乙醇水溶液消毒灭菌5‑10min，灭菌蒸馏水漂洗3‑5次，接种于MS培养基上，25℃暗共培养获得枸杞无菌叶片；(2)发根农杆菌A4活化：将发根农杆菌A4在含抗生素的LB固体培养基上划线，28℃暗处倒置培养36‑48h后获得单菌落，挑取单菌落于含抗生素的LB液体培养基上，28℃、摇床转速180‑220rpm暗培养36‑48h，得到活化发根农杆菌A4；所述发根农杆菌A4的载体上含有35S:RFP基因；所述RFP基因用SEQ.ID.NO1所示；(3)侵染外植体、共培养：将活化发根农杆菌A4涂抹在划口后的枸杞无菌叶片的伤口处，放在共培养基上，在24℃～25℃，光照16h、暗培养8h，培养4‑6d；(4)发根培养：将步骤(3)获得的枸杞叶片更换到发根培养基上，封口膜封好，24℃～25℃，光照16h，暗培养8h，培养25‑30d，每6‑8天更换一次发根培养基；(5)荧光检测；检测步骤(4)获得的毛状根中的RFP基因的红色荧光的存在与否；具有红色荧光的毛状根即为转基因枸杞毛状根。...

【技术特征摘要】
1.一种转基因枸杞毛状根的基因转化方法，其特征是包括以下步骤：
(1)制备枸杞无菌叶片：将枸杞叶片，清水冲洗干净后用无水乙醇擦拭表面，用乙醇水溶液
消毒灭菌5-10min，灭菌蒸馏水漂洗3-5次，接种于MS培养基上，25℃暗共培养获得枸杞无
菌叶片；
(2)发根农杆菌A4活化：将发根农杆菌A4在含抗生素的LB固体培养基上划线，28℃暗
处倒置培养36-48h后获得单菌落，挑取单菌落于含抗生素的LB液体培养基上，28℃、摇床
转速180-220rpm暗培养36-48h，得到活化发根农杆菌A4；所述发根农杆菌A4的载体上含
有35S:RFP基因；所述RFP基因用SEQ.ID.NO1所示；
(3)侵染外植体、共培养：将活化发根农杆菌A4涂抹在划口后的枸杞无菌叶片的伤口处，
放在共培养基上，在24℃～25℃，光照16h、暗培养8h，培养4-6d；
(4)发根培养：将步骤(3)获得的枸杞叶片更换到发根培养基上，封口膜封好，24℃～25
℃，光照16h，暗培养8h，培养25-30d，每6-8天更换一次发根培养基；
(5)荧光检测；检测步骤(4)获得的毛状根中的RFP基因的红色荧光的存在与否；具有红
色荧光...

【专利技术属性】
技术研发人员：金超，朱雪瑞，孔彦，季静，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津;12