单结构域抗体展示制造技术

本发明专利技术提供一种蛋白质，其包含串联的第一份和第二份拷贝的乙肝病毒核心抗原(HBcAg)，其中一份拷贝的HBcAg或两份拷贝的HBcAg包含在e1环中的单结构域抗体片段。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利
本专利技术涉及包含单结构域抗体片段的融合蛋白、编码这些融合蛋白的核酸分子、生产这些融合蛋白的方法、含有这些蛋白的药物组合物和疫苗组合物以及这些蛋白在治疗、疫苗接种和诊断中的用途。
技术介绍
抗体是实验研究和医学应用中的重要工具。大多数抗体由两个重链和两个轻链构成，重链和轻链共同构成两个相同的抗原结合位点。除了这些常规抗体之外，骆驼和某些软骨鱼类（例如鲨鱼）还产生仅由重链构成的抗体。这些重链抗体（hcAb）的抗原结合位点仅由单个结构域形成，该结构域在骆驼hcAb中被称为VHH（重链抗体的重链的可变区），在软骨鱼hcAb中被称为VNAR（鲨鱼新抗原受体的可变区）。VHH和VNAR能够以重组蛋白的形式生成，称为单结构域抗体（sdAb）。专利技术概述本专利技术涉及基于串联（tandem）乙肝病毒（HBV）核心蛋白的高度柔性（flexible）抗体呈现系统。专利技术人已证实，利用串联HBV核心构建体可以在HBV核心抗原（HBcAg）颗粒的表面上呈现活性（即抗原结合）形式的单结构域抗体（sdAb）片段。这种类型的抗体展示具有多种用途，包括在治疗、疫苗接种和诊断中的用途。令人关注的是，之前尝试利用更加普遍使用的单链可变片段抗体（scFv）实现在植物的串联核心蛋白的表面上的抗体展示。但是，表达产率非常低并且没有观察到颗粒形成。这最可能是因为scFv的结构更加复杂，其具有对应于轻链可变区和重链可变区的两个结构域，而sdAb片段仅具有对应于重链可变区的单个结构域。还值得注意的是，sdAb片段（VHH）无法展示于植物的单体（即非串联）HBcAg颗粒的表面：无法检测到重组蛋白（图7），表明折叠问题或位阻问题可能导致在蛋白上的瞬时降解。因此，本专利技术提供一种包含串联的第一和第二拷贝乙肝病毒核心抗原（HBcAg），其中一份HBcAg拷贝或两份拷贝包含在e1环（e1loop）中的sdAb片段。该技术的柔性（flexibility）是指其中一份HBcAg拷贝或两份拷贝都可包含在e1环中的sdAb。实质上，只要其中一份HBcAg拷贝包含在e1环中的sdAb，第二份HBcAg拷贝可包含任何感兴趣的蛋白。因此，该第二份HBcAg拷贝也可包含在e1环中的sdAb片段，该sdAb片段与第一份HBcAg拷贝的e1环中的sdAb相同或不同。或者，第二份HBcAg拷贝可包含在e1环中的不同外源蛋白。该抗体展示技术具有多种用途，某些用途可能需要将抗原加载到呈现于串联核心蛋白的sdAb上，而某些则不需要。例如，串联核心蛋白可被工程化以呈现治疗性抗体片段，用于治疗人体或动物体的疾病或病症。使用串联核心蛋白展示治疗性抗体片段的优点在于多个拷贝的蛋白可呈现于一个病毒样颗粒（VLP）或核心样颗粒（CLP）中，使得可以施用高剂量的治疗性抗体片段。该技术大大增加了每个单元的生物学活性，因为每个颗粒含有90-120个拷贝的抗体片段。此外，上述系统的柔性是指多于一种类型的sdAb片段能够以精确的1:1比率同时施用。作为另一个例子，串联核心蛋白可被工程化以呈现可加载抗原的sdAb片段，从而用作疫苗，以将抗原呈现给哺乳动物免疫系统。换句话说，抗原可被展示于VLP或CLP表面上，并通过抗体-抗原相互作用而被维持在表面上。因为抗原在呈现于串联核心的表面上时更具免疫原性，所以这样的系统可适合于具有低内在免疫原性的抗原的展示。该技术特别适合于需要以被免疫系统识别的特定构造呈现的抗原。本专利技术的蛋白也可用于诊断用途。例如串联核心蛋白可被工程化以呈现能够结合至感兴趣的抗原的sdAb片段，从而可用来检测是否存在该抗原。第二份拷贝的HBcAg可包含使蛋白质可视化的手段。例如，该第二份拷贝的HBcAg可包含在e1环中的荧光蛋白或生物发光蛋白。之前已显示，大的绿色荧光蛋白（GFP）可被串联核心携带。因此，如果第二核心中携带了单链抗体，那么可以设计用于任何分析物的简单荧光试验。例如，目标分析物可被结合至ELISA平板，随后加入荧光VLP。简单测定荧光即可确定目标物存在与否。虽然最初看起来与常规ELISA类似，但它具有大大提高灵敏度的这一额外优点，因为存在着多个拷贝的抗体。作为对比，链霉亲和素-生物素使ELISA灵敏度提高4倍，而本专利技术可提高100倍。本专利技术还提供：-包含多个拷贝的本专利技术的蛋白的颗粒；-编码本专利技术的蛋白的核酸分子；-包含本专利技术的核酸分子的宿主细胞；-生产本专利技术的蛋白的方法，该方法包括在蛋白表达的条件下培养含有编码该蛋白的核酸分子的宿主细胞，以及回收该蛋白；-包含本专利技术的蛋白、本专利技术的颗粒或本专利技术的核酸分子以及药学上可接受的载体或稀释剂的药物组合物；-包含本专利技术的蛋白、本专利技术的颗粒或本专利技术的核酸分子以及药学上可接受的载体或稀释剂的疫苗；-治疗人类或动物对象的方法，该方法包括向所述对象施用本专利技术的蛋白、本专利技术的颗粒或本专利技术的核酸分子；-诱导对象的免疫响应的方法，该方法包括向该对象施用本专利技术的蛋白、本专利技术的颗粒或本专利技术的核酸分子；-本专利技术的蛋白、本专利技术的颗粒或本专利技术的核酸分子在治疗人体或动物体的方法中的应用；-本专利技术的蛋白、本专利技术的颗粒或本专利技术的核酸分子在人体或动物体的疫苗接种方法中的应用；-本专利技术的蛋白或包含多个拷贝的本专利技术的蛋白的颗粒在检测样品中的抗原中的应用；以及-检测样品中的抗原的方法，所述方法包括将本专利技术的蛋白或包含多个拷贝的本专利技术的蛋白的颗粒施用至该样品。附图简述图1：可能的串联核心构建体的示意图。sdAb片段可被插入到插入位点I和/或插入位点II。图2：(A)X射线晶体学数据显示由HBV核心蛋白形成的天然二聚体。它是所形成的病毒样颗粒的主要构成成分。(B)分子模拟表明串联核心构建体的折叠显得不能与单体核心相区别。注意：在两个核心之间加入接头序列确保它们以单个蛋白形式表达。图3：(A)单体（左）和串联（右）核心蛋白形成的VLP的电镜图像。VLP显得具有相同的形态。(B)冷冻电子显微镜确认单体（左）和串联（右）核心构建体以相同方式折叠。图4：tHB-VHH核心样颗粒的电镜图像。上：无GFP颗粒（标尺20nm）；下：有GFP颗粒（标尺100nm）。图5：不同植物提取物在蔗糖垫上的运动图。超速离心后，当存在tHB-VHH（展示抗-GFP抗体片段的颗粒）时，GFP仅迁移至高浓度蔗糖处。该结果证实tHB-VHH颗粒结合GFP，表明VHH在核心样颗粒（CLP）的表面上正确折叠并且有活性。图6：蔗糖梯度组分的Western杂交本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蛋白质，其包含串联的第一份和第二份拷贝的乙肝病毒核心抗原(HBcAg)，其中一份拷贝的HBcAg包含或两份拷贝的HBcAg都包含在e1环中的单结构域抗体片段。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.06.06 US 61/831,7071.一种蛋白质，其包含串联的第一份和第二份拷贝的乙肝病毒核心抗原(HBcAg)，其中
一份拷贝的HBcAg包含或两份拷贝的HBcAg都包含在e1环中的单结构域抗体片段。
2.根据权利要求1所述的蛋白质，其中两份拷贝的HBcAg都包含在e1环中的单结构域抗
体片段。
3.根据权利要求1所述的蛋白质，其中第一份拷贝的HBcAg包含在e1环中的所述单结构
域抗体片段，第二份拷贝的HBcAg包含在e1环中的外源蛋白。
4.根据权利要求3所述的蛋白质，其中外源蛋白包括表位或是荧光蛋白或生物发光蛋
白。
5.根据前述权利要求的任一项所述的蛋白质，其中单结构域抗体片段结合至抗原。
6.根据前述权利要求的任一项所述的蛋白质，其中：
（a）HBcAg的串联拷贝通过接头连接；和/或
（b）其中一份拷贝或两份拷贝的HBcAg的e1环中的单结构域片段在一侧或两侧连接有
接头。
7.根据权利要求6所述的蛋白质，其中：
（a）所述或每个接头至少为1.5nm长；和/或
（b）所述或每个接头包含多个拷贝的序列GlynSer(GnS)，其中n为2至8。
8.一种颗粒，其包含多个拷贝的如前述权利要求的任一项所述的蛋白质。
9.一种编码权利要求1至7的任一项所述的蛋白质的核酸分子。
10.根据权利要求9所述的核酸分子，其中所述核酸分子是表达载体。
11.一种包含权利要求9或10所述的核酸分子的宿主细胞。
12.一种生产权利要求1至7的任一项所述的蛋白质的方法，其中所述方法包括在该蛋
白质表达的条件下培养...

【专利技术属性】
技术研发人员：大卫·J·罗兰，乔治·罗莫诺索夫，哈德恩·皮雷特，
申请(专利权)人：大卫·J·罗兰，乔治·罗莫诺索夫，哈德恩·皮雷特，
类型：发明
国别省市：英国;GB