用于检测硫酸化寡糖的分析方法技术

本发明专利技术描述了使用与电离子检测器(charged aerosol detector；CAD)或质谱仪(MS)偶联的亲水性相互作用超高效液相层析仪(HILIC-UPLC)检测及定量多硫酸化寡糖(包括磺达肝素钠(Fondaparinux sodium))的分析方法。此分析方法通过分离、定量及质量(mass)鉴定在高度硫酸化寡糖的全合成中提供过程中控制。同时提供了使用该方法的系统及条件。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉引用不适用
技术介绍
类肝素(肝素及硫酸乙酰肝素(Heparansulfate))是多个重要生物过程中已知的调节介质。类肝素及其衍生物低分子量肝素(low-molecularweightheparin,LMWH)已在外科手术及肾透析期间用作临床抗凝血药物。例如，磺达肝素钠(CAS114870-03-0)是化学名称为O-[2-脱氧-6-O-磺酸基-2-(磺酰胺基)-α-D-吡喃葡萄糖]-(1--4)-O-(β-D-吡喃葡萄糖醛酸)-(l--4)-O-[2-脱氧-3，6-二-O-磺酸基-2-(磺酰胺基)-α-D-吡喃葡萄糖]-(l--4)-O-(2-O-磺酸基-α-L-吡喃艾杜糖醛酸)-(1--4)-O-[2-脱氧-1-O-甲基-6-O-磺酸基-2-(磺酰胺基)-α-D-葡萄吡喃糖苷]十钠盐的寡糖/肝素中的一员，由Choay，S.A.研发(参见美国专利第4,818,816号)。该化合物是一合成的戊多糖因子Xa抑制剂，其用作预防经骨外科手术的患者的深层静脉栓塞以及治疗深层静脉栓塞及肺栓塞的抗凝血药物。磺达肝素钠于2001年经美国食品药物管理局批准，以商品名ArixtraTM出售。磺达肝素钠为皮下用药。肝素及硫酸乙酰肝素分析方法在传统上涉及逆相层析及质谱(MS)技术，但因硫酸乙酰肝素的高极性、结构多样性及硫酸盐不稳定性而存在限制。例如，使用MS对于合成的多硫酸化寡糖进行定量受到限制，因为多硫酸化寡糖离子化时易于形成多种类型硫酸根基团损失的片段及金属阳离子偶合加成物，这会导致更大的质谱复杂性及信号分裂。另外，在分析期间难以显示硫酸根基团的损失程度，因为其取决于硫酸化寡糖的浓度及电荷态。改良的多硫酸化寡糖分析方法是多组研究团队的目标。Catalin等人(Anal.Chem.2009，81,3485)及Tatiana等人(Anal.Chem.2006，78,1774)已分别阐述了通过使用电喷洒游离质谱(ESI-MS)及基质辅助激光解吸电离质谱(MALDI-MS)来表征多硫酸化寡糖。然而，目前使用液相层析(LC)与质谱偶联的方法无法提供在线过程内层析峰的解析/分离且因此在产生合成的多硫酸化寡糖期间无法建立结构相关杂质的鉴定和/或多硫酸化寡糖的定量。Imanari等人(J.Chromatogr.,A1996,720,275.)及Rice等人(J.Anal.Biochem.1985，150，325.)阐述了借助强阴离子交换层析(SAX)分析多硫酸化寡糖的方法。此方法使用电荷密度差异来分离高度硫酸化寡糖，但因在流动相组合物中使用非挥发性盐类，故仍难以直接将SAX与像MS的检测方法偶联。与多硫酸化寡糖分析方法相关的另一些问题是因多硫酸化寡糖的非发色特性(极低UV吸收)所致，此会限制传统UV检测器的使用。其他通用检测器(例如折射率(RI)检测器及蒸发光散射检测器(ELSD))亦对多硫酸化寡糖缺乏足够检测灵敏度。尽管已公开了一些多硫酸化寡糖检测方法，但仍存在多种限制。因此，仍需要改良用于多硫酸化寡糖的分离、定量及质量(mass)鉴定的方法。本文所公开的稳定、灵敏且过程中控制(in-processcontrol，IPC)方法解决了此需要及其他需要。专利技术概要本文提供使用与电离子检测器(chargedaerosoldetector，CAD)或质谱仪(MS)偶联的亲水性相互作用超高效液相层析仪(HILIC-UPLC)检测多硫酸化寡糖的方法。本文所提供方法使得峰分辨率改良，因而允许样品中多硫酸化寡糖和/或杂质的后续定量。HILIC的使用克服了滞留及分离极端极性寡糖的挑战。HILIC的滞留机制极为复杂且为液液分配、吸附、离子相互作用及疏水性相互作用的多模式组合。因此，与逆相液相层析(RPLC)相比，HILIC提供独特的选择性及滞留特性。如本文所述，在一组实施例中，用于HILIC管柱中的固定相是酰胺键合固定相。在另一实施例中，用于HILIC管柱中的流动相包含盐类。在一组实施例中，该盐类为甲酸铵。与甲酸吡啶鎓盐及乙酸铵相比，甲酸铵的使用对滞留、选择性提供更佳的性能及低噪声基线。在一些实施例中，盐类浓度高于50mM。在一些所选实施例，浓度高于100mM。通常，流动相组合物中盐添加剂的摩尔强度会对层析滞留、选择性及灵敏度具有显著影响。随着盐添加剂的摩尔浓度增加，液液分配相互作用压制了流动相与溶质的离子强度，其支配了滞留机制而非离子交换作用。然而，现已发现在酸性分析物(例如多硫酸化寡糖)的情形下，滞留随着盐添加剂的摩尔浓度增加而增强。具体而言，峰分辨率由于盐浓度自50mM增加至约200mM而得以进一步改良。在一组实施例中，用于HILIC管柱中的流动相的溶剂为乙腈。在一些实施例中，用于定量多硫酸化寡糖的检测器是电离子检测器(CAD)。在使用CAD进行分析期间，用电离气体(通常为氮气)使雾化粒子带电。在去除高流动性粒子(主要为过量N2离子)后，对雾化粒子实施电测量。最重要的是，已证实该方法对非挥发性分析物提供独立于其性质的均一响应。因此，⑴HILIC或HILIC-UPLC的分离技术与(2)诸如MS或CAD的检测技术的组合使得多硫酸化的检测、鉴定和/或定量能够进行，因而提供用于分析合成多硫酸化寡糖的有效方式。根据本专利技术的一个优选实施例，借助本文所述方法检测和/或定量的多硫酸化寡糖为磺达肝素钠。附图说明图1(a)提供使用Merck,Sequant(3.5um2.1×250mm)的磺达肝素钠的HILIC-CAD色谱图。图1(b)提供使用Merck,Sequant(5um4.6×150mm)的磺达肝素钠的HILIC-CAD色谱图。图1(c)提供使用Phenomenex,SynergiPolar-RP(4um4.6×250mm)的磺达肝素钠之HILIC-CAD色谱图。图1(d)提供使用Phenomenex,SynergiFusion-RP(4um4.6×150mm)的磺达肝素钠的HILIC-CAD色谱图。图1(e)提供使用SepaxPolar-Pyridine(1.8um2.1×150mm)的磺达肝素钠的HILIC-CAD色谱图。图1(f)提供使用ES,EpicDiol(1.7um2.1×150mm)的磺达肝素钠的HILIC-CAD色谱图。图1(g)提供使用Waters,AcquityBEHHILIC(1.7um2.1×150mm)的磺达肝素钠的HILIC-CAD色谱图。图1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测及定量样品中一或多种多硫酸化寡糖的方法，所述方法包括：(a)在与电离子检测器(CAD)或质谱仪(MS)偶联的亲水性相互作用超高效液相层析仪(HILIC‑UPLC)管柱上对该样品实施层析，其中用于HILIC管柱中的固定相是酰胺键合固定相；及(b)测定该样品中多硫酸化寡糖的量。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于检测及定量样品中一或多种多硫酸化寡糖的方法，所述方法包
括：
(a)在与电离子检测器(CAD)或质谱仪(MS)偶联的亲水性相互作用超高效液相
层析仪(HILIC-UPLC)管柱上对该样品实施层析，其中用于HILIC管柱中的固定相
是酰胺键合固定相；及
(b)测定该样品中多硫酸化寡糖的量。
2.如权利要求1所述的方法，其中用于HILIC管柱中的流动相包含盐。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述盐选自甲酸铵、甲酸吡啶鎓盐及乙酸
铵。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述盐是甲酸铵。
5.如权利要求3所述的方法，其中所述盐是甲酸铵且以约50mM至300mM
的浓度存于所述流动相中。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述流动相中甲酸铵的浓度是...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵家玉，王重尧，黄亦敏，吴佳燕，江勇德，
申请(专利权)人：台湾神隆股份有限公司，
类型：发明
国别省市：中国台湾;71