一种纳米粒子组合物及其抗肿瘤应用制造技术

本发明专利技术涉及到一种纳米粒子组合物及其抗肿瘤应用。所述纳米粒子组合物为聚合物载体和表达治疗基因的质粒自组装而成的纳米粒子；所述聚合物载体为环糊精-聚乙烯亚胺-聚乙二醇-叶酸四元组装式聚阳离子载体；所述表达治疗基因的质粒为包含编码肝细胞生长因子的HGFK1蛋白DNA序列的真核表达质粒。与现有技术相比，本发明专利技术具有高效和肿瘤靶向的特点；在水溶液中可以通过静电相互作用自组装为纳米粒子，而纳米粒子的粒径及盐溶液中的稳定性，对纳米粒子的功能有重要作用；经验证，可以预防癌症的转移或复发，减轻、缓解、控制、改善或治愈原发性癌症或转移性癌症或其相关的症状，也可延长癌症患者的寿命或活存时间，降低死亡率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于药物制备
，具体来说，涉及到一种纳米粒子组合物及其抗肿瘤应用。
技术介绍
恶性肿瘤(癌症)是人类的重大疾病,加强新型抗肿瘤药物的研究和开发具有十分重要的意义。全球现有恶性肿瘤患者超过2200万人，每年新诊患者达1010万人，每年死于肿瘤超过620万例。我国现有恶性肿瘤患者至少300至400万人，每年新诊患者超过160万人，年死亡人数超过130万。随着我国经济和社会的快速发展、平均寿命的延长、饮食结构和环境因素的改变，肿瘤发病率和死亡率呈迅速上升趋势，疾病谱也发生了重大变化，目前在农村地区人口肿瘤居死因第三位(107.1/10万人)，而在城市人口死因中已位居第一(126.0/10万人)。手术、放疗和化疗是肿瘤的常规治疗手段。手术、放疗只适合于局部发生的肿瘤；对已发生转移的中晚期肿瘤，细胞毒性化疗药物仍是一线治疗方案；然而，长期以来，常规化疗药物一直存在毒副作用大，病人耐受性差，长期使用引起赖药性等等问题；而对一些对化疗药物不敏感的肿瘤类型，患者还处于无药可治的状态。因此，开发低毒、高效及肿瘤靶向性特性的抗癌治疗技术，成为当前研究及治疗的重点。肿瘤的基因治疗是当前肿瘤生物治疗研究的热点之一。它是利用载体转导遗传物质(DNA,RNA)到机体细胞，通过表达治疗基因或者调控目的基因的转录及表达，特异性的干涉肿瘤组织的生长、发育而达到抑制或者清除肿瘤的目的。除了具有靶点明确，低毒、病人易耐受的生物药物的优点之外，基因药物与蛋白药物相比还拥有以下优点：1、转导基因进入人体细胞后，完全利用细胞自身的蛋白转录及修饰系统产生治疗蛋白与生理蛋白功能更接近；2、可通过对编码基因开放读码框架中转录元件的分子生物学改造，实现持续、高效及组织细胞特异性的治疗蛋白表达；3、针对肿瘤患者的个体化差异，设计治疗基因，制作工艺简单，可以实现快速有针对性的患者个体化治疗。自1990年第一个基因治疗药物被美国FDA批准进行临床测试以来，在欧美国家已经有超过1000个基因治疗方案在进行临床测试，其中60％是用于治疗肿瘤。多个治疗基因在临床测试中显示了明确的抗肿瘤功效；或者联合化疗、放疗使用，减少化其毒副作用，提高病人的可耐受性。已经被临床测试的基因包括：抑癌基因、肿瘤免疫治疗基因、抗血管生成基因、致死基因等等。然而，迄今为止，没有一个基因药物被欧美国家批准进入市场。缺乏高效、安全的基因药物传递技术是限制基因治疗临床应用的一个主要问题。病毒载体是当前基因治疗使用的主流载体。基于与生俱来、结构精巧的基因转导系统，这些人工重组病毒显示了高的基因转染效率、优秀的生物相容性。然而，1999年逆录病毒基因治疗导致两个儿童患者产生细胞恶变的事件，使人们对基因组整合性病毒载体的生物安全性问题产生了质疑！非病毒基因传递技术是近年发展的新兴基因传递技术。它主要是使用正电子聚合物(polymer)通过静电相互作用，包裹和浓缩长链的基因(DNA或者RNA)药物形成粒子，以避免基因药物的降解及促进基因的转导。与病毒载体相比较，非病毒载体具有生物安全性好、制作简单、成本低、免疫原性小，而且容易进行化学修饰等优点。基于这些优势，非病毒载体得到基因治疗学家愈来愈多的关注。近十年来，众多的化学生物学家合成了大量的非病毒载体,包括：多种脂质体及其衍生物；多种多聚亚胺(PEI)、多聚赖氨酸(PLL)，Dentrimers,壳聚糖(Chitosan)及其衍生物等等。然而，商业提供的基因转染试剂还存在毒性大、只适合瞬时转染、缺乏肿瘤靶向性等等，远不能适应临床基因治疗应用需求。肿瘤靶向性纳米基因药物传递技术主要是通过纳米载体材料及工程技术，将治疗基因制作成纳米级(1-100纳米)的药物粒子，通过对纳米颗粒大小及形态的控制，表面的修饰及肿瘤靶向性配体的嫁接，而实现基因药物肿瘤靶向性传递的技术方法。纳米粒子肿瘤靶向性的生理基础是肿瘤血管的结构特征。肿瘤是高度异质性的组织，其血管内皮细胞之间的间隙常大于100纳米，且基底膜不健全、缺少血管外周组织，有利于100纳米左右的纳米粒子通过和渗透；而正常的组织血管内皮间隙为5-10nm，可阻止粒径较大的粒子渗透和通过，减少正常细胞对抗癌药物的吸收，降低其毒副反应；其次，肿瘤组织淋巴回流系统发育不完善，有的甚至缺乏淋巴组织，导致渗透到肿瘤组织的纳米粒子不容易被排泄，这被称为肿瘤的延长稽留效应(ER)。要顺利到达肿瘤组织，纳米粒子还需克服机体的几个生理限制，包括：网状内皮系统的吞噬、清除，脾窦、肝窦的血液过滤作用等。纳米粒径大小及表面修饰是克服这些生理障碍的关键因素。常规来说，粒径小于5nm容易从肾脏排出，微米级粒子会被网状内皮系统清除，大于200nm粒子常常不能透过肝窦或者脾窦。除了粒径以外，纳米粒子表面亲水性修饰及电荷特性也影响网状内皮系统对纳米粒子的识别和清除。常规来说，经亲水性阻滞剂修饰，或者表面电荷低的纳米粒子，能避开体内网状内皮系统的识别及清除，延长药物粒子体内的血液循环半衰期，增加肿瘤组织的靶向聚集。在纳米粒子聚集到肿瘤以后，增加肿瘤细胞的吸收也是提高药效的关键。通过连接肿瘤细胞特异性配体到纳米粒子，使其通过受体配体调节的细胞内吞途径进入肿瘤细胞，可以增加肿瘤细胞对药物的吸收。抗血管生成是广泛使用的抗实体瘤生物治疗方案。常规来说，当肿瘤体积较小时，肿瘤细胞可以通过渗透作用获取其生长所需的营养。当肿瘤直径超过渗透限制时(1-2mm)，肿瘤血管生成将会发生。此后，其将促进或加快实体瘤的生长，并为肿瘤的转移提供通道。自上世纪70年代Folkman等人开启抗肿瘤血管研究以来，大量的血管生成抑制物已经被发现和报道，它们可以被归纳为外源性和内源性抗血管生成抑制剂两类。外源性抗血管生成抑制剂主要是一些具有蛋白酶抑制功能的小分子化合物，其抗血管生成作用明显，同时毒副作用也很大。而内源性抗血管生成因子毒副作用较小，但是，要达到治疗效果，通常需要持续反复的给药。一些抗血管生成的靶点药物已经被多个国家批准开展临床实验，但是疗效不如预期。最近的研究发现：当一个血管生成通路被抑制后，肿瘤细胞可以建立其它的通路，诱导新的血管生成；抑制肿瘤血管生成导致肿瘤缺氧，可诱发肿瘤干细胞的活化，从而引起肿瘤复发。这些可能是抗血管生成抑制剂临床疗效欠佳的主要原因。最近，研究发现，腺相关病毒转导人类肝细胞生长因子的三环片段(thekringle1domainofhumanHGFα-chain，HGFK1)通过干扰EGFR，VEGFR2和bFGFR信号通路，而发挥抗肝癌作用。但是，这些病毒载体的基因治疗方案，仍然存在由基因组整合引起的生物安全和机体对病毒载体的免疫反应等问题。而，多肽类药物要达到治疗效果需要持续高剂量重复给药，这将严重影响治疗的效果，增加治疗成本。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种安全、高效、长效的纳米粒子组合物及其抗肿瘤应用。本专利技术所述的一种纳米粒子组合物，所述纳米粒子组合物为聚合物载体和表达治疗基因的质粒自组装而成的纳米粒子；所述聚合物载体为环糊精-聚乙烯亚胺-聚乙二醇-叶酸四元组装式聚阳离子载体；所述表达治疗基因的质粒为包含编码肝本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种纳米粒子组合物，其特征在于，所述纳米粒子组合物为聚合物载体和表达治疗基因的质粒自组装而成的纳米粒子；所述聚合物载体为环糊精‑聚乙烯亚胺‑聚乙二醇‑叶酸四元组装式聚阳离子载体；所述表达治疗基因的质粒为包含编码肝细胞生长因子的HGFK1蛋白DNA序列的真核表达质粒。

【技术特征摘要】
1.一种纳米粒子组合物，其特征在于，所述纳米粒子组合物为聚合物载体和表达治疗基因的质粒自组装而成的纳米粒子；所述聚合物载体为环糊精-聚乙烯亚胺-聚乙二醇-叶酸四元组装式聚阳离子载体；所述表达治疗基因的质粒为包含编码肝细胞生长因子的HGFK1蛋白DNA序列的真核表达质粒。
2.根据权利要求1所述的一种纳米粒子组合物，其特征在于，所述环糊精-聚乙烯亚胺-聚乙二醇-叶酸四元组装式聚阳离子载体的结构式选自式1或式2；所述式1的结构式具体为：
PEI600-CyD-PEG-FA；
所述式2的结构式具体为：
PEI600-CyD-PEG-FA；
式1和式2中，n为环糊精-聚乙烯亚胺-叶酸-聚乙二醇的单元结构数目，取值范围5-10，m1为聚乙烯亚胺中的仲氨基单元结构数目，取值为4-8，m2为聚乙烯亚胺中的叔氨基单元结构数目，取值为2-5，L为聚乙二醇中氧乙烷单元结构数目，取值范围42-105。
3.根据权利要求1所述的一种纳米粒子组合物，其特征在于，所述表达治疗基因的质粒为phEF1-HTLV-Igk-HGFK1-SV40，通过从人正常肝细胞LO2提取表达人HGFK1的DNA模板后再亚克隆到phEF1-HTLV-Igk-XXX-SV40质粒制得。
4.根据权利要求3所述的一种纳米粒子组合物，其特征在于，所述phEF1-HTLV-Igk-XXX-SV40包括：1)杂交启动子：人延伸因子-1α启动子和人T细胞白血病病毒的5’非转录区序列，见SEQIDNO1，其能在哺乳动物细胞内长期启动调控基因的表达；2)编码分泌表达信号肽IgK链引导序列的DNA序列，见SEQIDNO2；3)编码表达治疗基因DNA序列：内皮抑素DNA序列，见SEQIDNO3；4)猴肾病毒polyA序列：见SEQIDNO4；
SEQIDNO1：GGATCTGCGATCGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGCTGAAGCTTCGAGGGGCTCGCATCTCTCCTTCACGCGCCCGCCGCCCTACCTGAGGCCGCCATCCACGCCGGTTGAGTCGCGTTCTGCCGCCTCCCGCCTGTGGTGCCTCCTGAACTGCGTCCGCCGTCTAGGTAAGTTTAAAGCTCAGGTCGAGACCGGGCCTTTGTCCGGCGCTCCCTTGGAGCCTACCTAGACTCAGCCGGCTCTCCACGCTTTGCCTGACCCTGCTTGCTCAACTCTACGTCTTTGTTTCGTT...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚宏，林李家宓，孔祥复，郑骏年，沈赞，
申请(专利权)人：徐州医学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32