一种水蛭多肽的分离纯化方法技术

本发明专利技术公开了一种水蛭多肽的分离纯化方法，首先将水蛭提取物加入模仿人体肠细胞吸收的系统中培养，然后将被吸收的物质进行层析分离即可。本发明专利技术的发明专利技术人从不同的角度解决了水蛭多肽的分离纯化男的问题，通过将水蛭提取物首先采用Caco-2细胞进行纯化，模仿了中药水蛭在体内的消化吸收过程，经过模拟肠道细胞的吸收作用，将大量的不能被人体肠道细胞吸收的多肽首先分离出来，简化了分离纯化过程，然后再经过阴离子交换柱层析和凝胶过滤层析既可以分离纯化得到能被人体吸收利用的多肽。通过本发明专利技术的方法分离纯化得到的多肽具有抑制血管平滑肌细胞迁移的作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于医药领域，具体涉及。
技术介绍
动脉粥样硬化是由于脂质在动脉血管壁中大量堆积而导致的动脉管壁增厚、变硬，进而使动脉失去弹性、管腔狭窄。它是一种由多种细胞及细胞因子共同参与的慢性炎性疾病。随着对动脉粥样硬化病变过程研究的不断深入，动脉粥样硬化相关细胞间的相互作用以及细胞因子与细胞的相互作用等炎症因素被越来越多的研究。参与动脉粥样硬化的细胞主要包括:血管内皮细胞，血管平滑肌细胞以及免疫细胞，其中免疫细胞主要为巨噬细胞，此外还有中性粒细胞、肥大细胞、树突细胞以及T细胞等。血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VSMCs)的增殖、迀移在动脉粥样硬化病变的形成过程中也起着关键性的作用。VSMCs是血管壁的重要构成成分，主要位于血管中膜，生理条件下，VSMCs的增殖和凋亡之间保持平衡，而在许多病理状态下可使其增殖失控，从而引起血管壁的一系列变化。血管内膜中仅存在少量VSMCs，其主要作用是通过舒张和收缩改变血管直径，使血管保持适当的血流压力，此时的VSMCs表现为收缩型，其增殖及合成能力很低。在多种病理因素的作用下，VSMCs的表型可由收缩型转化为合成型。合成型的VSMCs能够合成和分泌大量细胞外基质，从而改变细胞周围的微环境，而细胞外基质又可影响VSMCs的增殖、黏附和迀移过程。炎性反应可刺激VSMCs发生迀移、增殖，并与炎性病变内的炎性成分相互作用，使动脉壁增厚。单核细胞的蓄积、VSMCs增殖和纤维组织形成导致病变进一步扩大并重组成为覆盖在脂质核心和坏死组织上的纤维帽，最终导致斑块复合型病变的形成。因此，VSMCs也是推动动脉粥样硬化进程的关键细胞之一。水蛭(Leech)作为传统中药用于治疗多种疾病，在我国古代医书中多有记载。例如《神农本草经》中谓其“主逐恶血、瘀血、月闭、破血消积聚……”。水蛭药理作用广泛，包括抗凝、抗血栓、抗肿瘤、抗炎、内皮细胞保护以及抗纤维化等。在心脑血管疾病临床治疗中，中药水蛭及含有水蛭的中成药或复方制剂已广泛应用于冠心病、心绞痛、急性心肌梗塞、缺血性脑中风(如脑血栓、脑梗塞及其后遗症)、高血压、高血脂、脑动脉粥样硬化等疾病、动脉粥硬化及周围血管病等疾病的防治。近年来关于水蛭防治心脑血管疾病的基础研究不断深入。国内对水蛭药理作用的研究报道主要包括三个方面:抗凝作用，对心脑血管疾病的治疗作用，对糖尿病视网膜病变的治疗研究。但是由于水蛭多肽的复杂性和活性筛选的难度，目前没有简便的活性水蛭多肽的分离纯化方法。
技术实现思路
本专利技术的目的就是为了提供。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案:—种水蛭多肽的分离纯化方法，首先将水蛭提取物加入模仿人体肠细胞吸收的系统中培养，然后将被吸收的物质进行层析分离即可。优选:水蛭提取物的提取方法如下:取水蛭干燥全体粉碎成20-150目粉末，加入6-16倍重量的水，或者水蛭鲜活全体，加入1-6倍重量的水，匀浆;取匀浆液，调节pH至7-9，按每lg水蛭干药材加入2000-20000U酶的比例加入胰蛋白酶，控制温度40-60°C，酶解2-12小时，冷却至室温;酶解完后，向上述酶解液中加入1-5倍体积的丙酮或者乙醇冷藏沉淀4-12小时，过滤，滤液减压干燥，得水蛭提取物。优选:模仿人体肠细胞吸收的系统为长满/具有人结直肠腺癌Caco-2细胞的transwell 小室。优选:所述培养条件为在37°C，5% 二氧化碳，饱和湿度条件下培养0.5-10h(优选2h)0优选:水蛭提取物加入模仿人体肠细胞吸收的系统前，使用pH值7.2的roS配置成浓度为0.5-5mg/ml的溶液。优选:层析分离首先经阴离子交换柱层析(优选:阴离子交换柱层析介质为QSephrose)，浓度为0.5-2mol/L的NaCl溶液线性洗脱，收集各个峰的活性成分，经血管平滑肌细胞迀移筛选，取活性最高的一个峰的活性成分，浓缩并干燥，然后将浓缩并干燥后的活性成分，用蒸馏水溶解，再经过凝胶过滤层析(优选:所述凝胶过滤层析柱的填料:分离范围为100-5000道尔顿的填料，更优选:所述凝胶过滤层析柱的填料为Sephadex LH-20)，蒸馈水洗脱，收集各个峰的活性成分，经血管平滑肌细胞迀移筛选，取活性最高的一个峰的活性成分，浓缩并干燥，即得分离纯化后的水蛭多肽。本专利技术还保护上述的分离纯化方法得到的水蛭多肽，以及所述水蛭多肽在制备抑制血管平滑肌细胞迀移药物中的应用。—种抑制血管平滑肌细胞迀移的药物，其主要活性成分是上述方法分离纯化得到的水蛭多肽。所述水蛭多肽在制备治疗动脉粥样硬化药物中的应用。—种治疗动脉粥样硬化的药物，其主要活性成分是上述方法分离纯化得到的水蛭多肽。有益效果:水蛭提取物在使用层析方法进行分离纯化时，由于提取物含有多肽的量大且种类杂，多肽之间离子的净电荷、表面电荷分布的电性差异相差较小，所以使用常规的层析等方法直接分离时，难度较大，并且分离得到的多肽可能无法被人体吸收，现有的分离纯化方法一般都是通过改变层析柱的种类或改进层析方法来实现多肽的分离纯化，本专利技术的专利技术人从不同的角度解决了水蛭多肽的分离纯化难的问题，通过将水蛭提取物首先采用Caco-2细胞进行纯化，模仿了中药水蛭在体内的吸收过程，经过模拟肠道细胞的吸收作用，将大量的不能被人体肠道细胞吸收的多肽首先分离出来，简化了分离纯化过程，然后再经过阴离子交换柱层析和凝胶过滤层析，结合血管平滑肌迀移筛选模型即可以分离纯化得到能被人体吸收利用的活性水蛭多肽。通过本专利技术的方法分离纯化得到的活性水蛭多肽具有抑制血管平滑肌细胞迀移的作用。【附图说明】图1: transwell 小室说明；图2:Q Sephrose阴离子交换层析柱对transwell小室下室水輕多肽的分离纯化结果;图3:Sephadex LH-20凝胶过滤层析对水輕多肽的分离结果；图4:未采用Caco-2细胞纯化水輕提取物经QSephrose阴离子交换层析柱分离结果;图5:水蛭多肽(HEE)对血管平滑肌细胞迀移能力的影响，横坐标为加药分组，LPS(+ )为1.0yg/ml，辛伐他汀(SIM)(+)为ΙΟμΜ即4.1856yg/ml;纵坐标为血管平滑肌细胞迀移数目;#P<0.05vs空白对照，##P<0.01vs空白对照，*P<0.05vs造模组广P<0.01vs造模组，ΛΡ<0.05vs辛伐他汀组’MpC0.0lvs辛伐他汀组;bar为50μηι;图6:活性水蛭多肽(HEE)对血管平滑肌细胞炎症因子、趋化因子、粘附分子蛋白表达水平的影响，横坐标为加药分组，1^3( + )为1.(^8/1111，辛伐他汀(3頂)(+ )为1(^1即4.1856yg/ml;纵坐标为血管平滑肌细胞迀移数目；#P<0.05vs空白对照，##P<0.01vs空白对照，*P<0.05vs造模组广P<0.0lvs造模组，ΛΡ<0.05vs辛伐他汀组，^?<0.0lvs辛伐他汀组；图7:经QSephrose阴离子交换柱分离后各组分对血管平滑肌迀移作用结果；图8:经LH-20凝胶柱分离后各组分对血管平滑肌迀移作用结果。【具体实施方式】下面结合附图与实施例对本专利技术作进一步说明。实施例1:水蛭提取物的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种水蛭多肽的分离纯化方法，其特征是：首先将水蛭提取物加入模仿人体肠细胞吸收的系统中培养，然后将被吸收的物质进行层析分离即可。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：宋淑亮，吉爱国，成龙，
申请(专利权)人：山东大学威海，
类型：发明
国别省市：山东;37