本发明专利技术公开了一种改造转运蛋白Hip1p促进酿酒酵母利用组氨酸的方法，属于微生物遗传和分子生物学领域。本发明专利技术将转运蛋白Hip1p第30和/或42和/或52位的赖氨酸突变为精氨酸，从而解除Hip1p所受到的泛素化调控。减弱组氨酸转运蛋白Hip1p受到的泛素化调控，使其能够在细胞膜上发挥稳定功能，将有助于提高组氨酸的利用，从而有助于氮源的全面充分利用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种改造转运蛋白Hiplp促进酿酒酵母利用组氨酸的方法，属于微生 物遗传和分子生物学领域。
技术介绍
转运蛋白Hiplp是一种位于细胞膜上的组氨酸特异性透性酶。泛素化是蛋白质翻 译后修饰的主要方式之一，被泛素标记的蛋白质将进入泛素-蛋白酶体途径，并进一步被 液泡内的蛋白酶所降解。Hiplp受到泛素化调控，即Hiplp的泛素化位点（赖氨酸）被泛素 所识别并标记，并最终被胞内的蛋白酶所降解。因此，解除或减轻Bap2p的泛素化修饰，从 而减少其降解，将有助于其在细胞膜上的稳定存在并发挥氨基酸转运功能。 组氨酸为酿酒酵母非偏好型氮源，当培养基中存在偏好型氮源（谷氨酰胺、天冬 酰胺、谷氨酸等）时，酿酒酵母优先利用偏好型氮源；只有当偏好型氮源耗尽时，才开始利 用非偏好型氮源。酿酒酵母这种优先利用偏好型氮源的方式会带来许多不利的结果，如（1) 不利于对氮源的充分利用，（2)有害代谢产物（如氨基甲酸乙酯）的积累等。因此，减弱组 氨酸转运蛋白Hiplp受到的泛素化调控，使其能够在细胞膜上发挥稳定功能，将有助于提 高组氨酸的利用，从而有助于氮源的全面充分利用，且不会造成氨基甲酸乙酯等有害产物 的积累，在黄酒生产能减少氨基甲酸乙酯等有害产物。
技术实现思路
本专利技术要解决的问题是提供一种改造转运蛋白Hiplp促进酿酒酵母利用组氨酸 的方法。 本专利技术所述的改造转运蛋白Hiplp，指的是消除Hiplp的泛素化位点，从而解除 Hiplp所受到的泛素化调控。 所述的消除Hiplp的泛素化位点，指的是将转运蛋白Hiplp第30和/或42和/ 或52位的赖氨酸突变为精氨酸。 所述的将赖氨酸突变为精氨酸，指的是不同的突变位点的组合。 在本专利技术的一种实施方式中，编码所述转运蛋白Hiplp的核苷酸序列如SEQID NO. 1所示。 在本专利技术的一种实施方式中，所述的将赖氨酸突变为精氨酸，是将第30和42位的 赖氨酸同时突变为精氨酸，得到突变体HiplpK3°'42R。 本专利技术对酿酒酵母组氨酸转运蛋白Hiplp进行了遗传改造，弱化了其受到的泛素 化调控，提高了其对组氨酸的利用。【附图说明】 图1定点突变的组合方式 图2Hiplp系列突变体支链氨基酸利用情况【具体实施方式】 材料与方法下述实施例所用酿酒酵母菌株为S·cerevisiaeCEN·PK2-lD-Δubi4(MATαura3-52 ;trpl-289 ;leu2-3, 112 ;his3A1 ;Aubi4: :LEU2 ;MAL2-8c;SUC2)单倍体模式菌株，酿酒 酵母CEN·PK2-lD-Δubi4由酿酒酵母CEN·PK2-lD(MATαura3-52;trpl-289;leu2-3，112; his3Δ1 ;MAL2-8c;SUC2)敲除基因UBI4 得到，酿酒酵母CEN.PK2-1D购自EUROSCARF(Fran kfurt,Germany)，其他操作均为常规分子生物学操作。 实施例1YNB液体培养基：1. 74g/LYeastNitrogenBasewithoutAminoAcidsand AmmoniumSulfate，20g/LD_glucose，5g/L(NH4)2S04。亮氨酸、尿啼啶双缺陷型培养基 (DM-leu，ura) :YNB培养基中添加50μg/mL组氨酸、50μg/mL色氨酸。固体培养基为相 应的液体培养基中加入20g/L琼脂粉。 以酿酒酵母S.cerevisiaeCEN.PK2-1D-Aubi4基因组DNA为模版，使用引物 对HIP1-F/HIP1-R(表 1)扩增得到基因HIP1 (基因HIP1:SEQIDNO. 1)。HIP1 经挑 取单菌落及Sanger测序验证正确后，通过限制性酶切位点EcoRI和Smal连接至载体 pUbDetecl6(pUbDetecl6:SEQIDN0· 2)，得到重组表达载体pUbDetecl6-HIPl。重组表达载 体使用引物对pUbDetecl6-ver_F/R(表1)进行验证。挑选测序正确的重组质粒利用醋酸 裡转化法转化S·cerevisiaeCEN·PK2-lD-Δubi4，涂布DM-leu，ura固体培养基。于30°C 培养箱培养3-4d，挑选单菌落进行菌落PCR验证后接种相应的液体培养基。待生长至对数 期转接以便于后续试验。 酿酒酵母的醋酸锂转化法：将S.cerevisiaeCEN.PK2-1D-Aubi4在YTO培养基中 30°C，200rpm培养过夜后，转接至新鲜的40mLYH)培养基中，并使终浓度为106cell.mL1。 30°C，200rpm培养约 6h，待菌体生长至浓度为L2-L5X107cell·mLVODf；。。：L2-L5)。 收集菌体于4000rpm4°C离心5min收集全部细胞，用1倍体积的预冷无菌水洗涤细胞。 4000rpm4°C离心5min收集细胞，用1/2体积的预冷无菌水洗涤细胞。4000rpm4°C离心 5min收集细胞，加入4mL转化液并用移液枪将细胞和转化液混合均匀，室温孵育30min。 4000rpm4°C离心5min收集细胞，用lmLlmol，L1山梨醇悬浮细胞并转移至1. 5mL离心管 中。室温13000rpm离心30s，弃上清，重复该步骤两次。用100μLΙπιοΙ·]^1山梨醇悬浮细 胞，使终浓度为K^cell·πι?Α取40yL制备的感受态细胞并加入5yL(100yg)质粒或线 性DNA，混合后转入冰上预冷的0. 2cm电转杯中，冰上孵育5min。将电转杯放入电转仪中，参 数设定为1. 5kV、25μF，电击后立即加入lmLlmol*L1山梨醇。用移液枪混合均勾后（轻轻 吹吸，不要产生气泡），将得到的电击混合物转移至1. 5mL离心管中，30°C静置孵育lh。取 0. 2mL涂布相应的营养缺陷型平板，置于30°C培养箱3-4d后观察结果。 表1pUbDetecl6_HIPl表达载体构建及验证所用引物 泛素化位点的定点突变：采用定点突变的方法，将相应的泛素化位点（赖氨 酸）突变为精氨酸。采用快切酶Dpnl消化模板的方法进行定点突变。首先，以重组质粒 pUbDetecl6-HIPl为模板，使用2XSuperpfuMixDNA聚合酶扩增完整的重组质粒。PCR产 物经柱回收后添加Dpnl于37°C，反应lh，由于菌体自身的质粒模板会被甲基化修饰，而扩 增的质粒则不会被甲基化。通过Dpnl消化后就可以消除原始模板质粒。将酶切反应后的 混合液于PCR仪80°C，5min使酶失活后即可转化E.coliJM109。转化体系涂布含有适量氨 苄青霉素的LB平板，于37°C培养箱中静置过夜培养。随机挑取单菌落进行菌落PCR验证， 验证引物采用pUbDetecl6_ver_F/R。经Sanger测序验证正确的单克隆继续用于下一轮突 变，直到完成四重突变，定点突变的位点顺序如图1。 表2pUbDeteC16系列表达载体定点突变所用引物 泛素化位点消除对组氨酸代谢的影响：分别将活化的CEN. PK2-1D-Δubi4 、CEN.PK2-1D-Δubi4 、CEN.PK2-1D-Δu bi4、CEN.PK2-lD-Aubi4接种YNB液 体培养基（不添本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种促进酿酒酵母利用组氨酸的方法，其特征在于，消除酿酒酵母转运蛋白Hip1p的泛素化位点，从而解除Hip1p所受到的泛素化调控。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：周景文，陈坚，吕永坤，堵国成，李应宇，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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