本发明专利技术提供一种定量评价体外受精中使用的产品的方法。本发明专利技术还公开了一种用于临床辅助生殖技术(ART)的改进的质量控制分析方法。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】用于体外受精技术的基于分子的小鼠胚胎分析的方法和质 量控制 相关专利申请的夺叉引用 本申请要求2013年3月14日提交的、名称为"用于体外受精技术的基于分子的小 鼠胚胎分析的方法和质量控制"的美国临时专利申请第61/783, 557号的优先权，该美国临 时申请的全部内容通过引用并入本文。
本专利技术涉及评价细胞生物学（例如，体外受精）中使用的产品的方法。本专利技术还 公开了用于临床辅助生殖技术（ART)的质量控制分析方法。
技术介绍
体外受精（IVF)实验室在治疗不能生育的夫妻方面发挥重要作用。确保IVF实验 室中合适的质量控制（QC)对于任何IVF项目的成功而言都是至关重要的，因为实验室环境 可改变所产生的胚胎的质量。最优的培养基和稳定的环境对于人胚胎体外成功发育而言是 必需的。胚胎学实验室的最终作用是在女性生殖道之外的环境中保持配子和胚胎的固有生 存能力。植入前胚胎发育的动态性是独一无二的，因为胚胎不像体细胞培养物那样，胚胎在 形态和功能方面不断且快速地发生变化（Leese 1991 ;Bavister 1995)。 在发育过程中，植入前胚胎仅在几天的过程中就在母本转录本的基因控制下从 新陈代谢静止的未分化的单个细胞快速转变成动态的多细胞胚胎，该动态的多细胞胚胎 已发育出了自我平衡机制及其自身功能基因组（Leese 1991 ;Lane 2001 ;Gardner et al. 2005)。早期胚胎依赖于基于丙酮酸酯的代谢并且仅依赖于线粒体氧化磷酸化作用产生 能量；与单细胞生物体相似，所述早期胚胎缺乏很多用于pH和渗透控制的关键调节作用。 在8细胞期至16细胞期（取决于物种）进行压缩之后，代谢控制变成高度糖酵解代谢。同 时，随着胚胎生理学变得更加类似于体细胞，在其他细胞机制的功能复杂性方面也存在显 著的转变。该显著的转变是早期胚胎及其在植入前发育的后期阶段的后续发育过程中自我 平衡调节的最初的天然特性，这种最初的天然特性在实验室中产生很大的挑战。维持有利 的体外环境对于最大化生存能力以及促进不断发育而言是必需的。 相对于生殖道中遭遇的"正常"条件，培养物的发育过程中胚胎周围的环境的扰 动导致胚胎生存能力降低以及发育受损。如下文所讨论的，本领域需要用于测试在人IVF 中使用的物质的胚胎毒性以及生长促进因素和抑制因素的客观、灵敏且可重复的方法和分 析。
技术实现思路
在本领域中，通常难以使用形态作为标志物来评价次优环境对胚胎和其他细胞的 影响。例如，在一些情况下，发育成看起来形态正常的囊胚的胚胎事实上可能不完全正常或 健康。例如，这种看起来形态正常的囊胚可在细胞水平上受到损伤。损伤的囊胚的植入能 力和产生成功的足月妊娠的能力可能降低。在收集和培养过程中胚胎所暴露的环境可显著 改变胚胎的发育可能性和细胞调节作用。小鼠胚胎分析方法（MEA)是检查不涉及人类物质 的培养基和环境的适用性的金标准。用于执行MEA的基本抟术和规稈在体外夸精和怀胎转 移：基本技术指南（In Vitro Fertilization and Embryo Transfer:A Manual of Basic Techniques，Don P.Wolf，编辑，1988,第57-75页）中列举，该参考文献的全部内容通过引 用并入本文。简言之，分析方法涉及用孕马血清促性腺激素（PMSG)和人绒毛膜促性腺激素 (hCG)使雌性小鼠超数排卵。在注射hCG时将所述雌性小鼠与雄性小鼠放在一起，并在注射 hCG之后24小时杀死所述雌性小鼠以获得单细胞胚胎或在注射hCG之后36小时杀死所述 雌性小鼠以获得两细胞胚胎。如果单细胞胚胎具有两个极体可见物，选择使用单细胞胚胎， 如果两细胞胚胎看起来形态正常，那么选择使用两细胞胚胎。 MEA用于生殖培养基，实验室器具或待与配子和/或胚胎接触的任何设备的毒性 和功能性的测试。需要关于这类测试的信息作为II类辅助生殖设备的特定控制的基本原 理是这种测试是在辅助生殖设备中用于配子和/或胚胎的物质的潜在毒性的良好的替代 指示。FDA已认可了 MEA是目前用于胚胎毒性的最合适的测试。简言之，使用单细胞分析 和两细胞分析，并且除了单细胞胚胎相对于两细胞胚胎较早地从小鼠输卵管中冲刷出去之 外，单细胞分析和两细胞分析是等同的。无论使用单细胞MEA还是两细胞MEA，生物分析应 当尽可能代表所述设备用于人IVF的相应步骤，所述步骤例如，胚胎的获取、维持、培养、转 移（再定位）以及冷冻保存。通常，在培养96个小时之后评价胚胎形态并确定囊胚的形成。 如果多于80 %的受精卵已达到囊胚阶段，那么所测试的培养基、实验室器具或其他仪器被 认为适于临床应用。 除了检测胚胎毒性之外，MEA能够检测次优原材料、培养基和与IVF和ART有关的 接触物质。然而，该分析中还有很多通常被忽视的局限性。例如，所述分析可仅检测严重且 苛刻的胚胎毒性条件。MEA无法在发育的非常早的阶段检测或区别生长促进因素或生长抑 制因素。 本文描述的实施方式通常涉及提供用作例如体外受精（IVF)环境和/或辅助生殖 技术（ART)的质量控制的基于分子的小鼠胚胎分析（mMEA)的系统和方法，并且更加具体而 言，本文描述的实施方式涉及用于评价从单细胞期或两细胞期至囊胚期的胚胎发育的改进 的分析方法。 通过本专利技术的描述，结合其他方面，基于下文的描述和权利要求书，本专利技术的优势 变得清楚和明显，本专利技术的优势由下面部分中所描述的附图来支持。 -方面，本专利技术提供评价用于人IVF或ART的产品的质量控制方法。所述方法包 括提供转基因胚胎（至少单细胞）以及体外培养胚胎持续特定时间段。所述方法还包括评 估从单细胞期或两细胞期至囊胚期和超过囊胚期的胚胎发育。所测试的项目的可接受性或 失效基于胚胎发育的定量和定性分析来确定。任选地，单细胞胚胎包括可操作地连接至至 少一个胚胎发育/多能性调节子的调节区域的至少一个荧光蛋白转基因。 转基因可包括编码所选择的荧光蛋白的报告基因，所述荧光蛋白例如绿色荧光蛋 白（GFP)，红色荧光蛋白，蓝绿色荧光蛋白，桔色荧光蛋白或黄色荧光蛋白。 另一方面，所述质量控制方法和分析方法被设计为评估在IVF环境和/或ART中 使用的测试项目。所述测试项目可包括配子和胚胎培养基，配子和胚胎处理/加工培养基 (包括洗涤和分离培养基），运输培养基，用于剥离卵母细胞的酶，精子分离梯度，冷冻/玻 璃化培养基，解冻/加温培养基，吸管和胚胎处理设备，在人体外受精过程中使用的实验室 器具，所述实验室器具包括但不限于：培养皿，离心管，冷冻保存和低温贮存设备以及体外 ART相关步骤所涉及的任何溶液、试剂或设备。 另一方面，评估胚胎发育通过分析与胚胎的发育阶段相关的一般胚胎形态和/或 荧光位置/数量/品质来完成。优选地，所述胚胎来源于哺乳动物，并且可包括鼠胚胎、猪 胚胎、马胚胎、牛胚胎、绵羊胚胎、兔胚胎和非人类灵长类动物胚胎。 再一方面，可操作地连接的胚胎多能性调节子可包括但不限于：0ct-4，S 〇x2， Nanog，CDX2和Rexl以及它们的上游介导物和下游效应子，所述上游介导物和下游效应子 在确保正常胚胎发育方面发挥作用。 胚胎发育可在任何或全部阶段进行评价，所述阶本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种评价用于辅助生殖技术(ART)的产品的方法，所述方法包括：提供转基因胚胎，其中，所述胚胎包括可操作地连接至至少一个胚胎生存能力标志物的调节区域的至少一个报告基因和/或可操作地连接至至少一个胚胎生存能力标志物的调节区域的至少一个转基因；体外培养所述胚胎持续特定时间段；在所述胚胎发育的至少一个阶段评估所述至少一个报告基因和/或所述转基因的表达；以及基于所述评估确定所述产品的可接受性或失效，其中，所述产品以与其在ART中的预期使用类似的方式在所述方法中使用。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：赫夏诺滋·尼，萨米拉·艾斯萨拉米，丽贝卡·苏珊·吉伯，
申请(专利权)人：尔湾科学销售公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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