本发明专利技术公开了一种检测小反刍兽疫病毒（PPRV）的可视化逆转录环介导等温扩增试剂盒，该试剂盒包括RT-LAMP引物、2×反应缓冲液、酶混合物EM、荧光目视检测试剂、超纯水和反应模板，所述的RT-LAMP引物包括外引物F3与B3、内引物FIP与BIP和环引物LF与LB，该检测试剂盒主要用于检测疑似PPRV感染的病变组织是否存在PPRV。特异性检测和敏感性检测证实，本发明专利技术提供的RT-LAMP试剂盒可实时监测反应并且定量检测出小反刍兽疫病毒的拷贝数，快速准确的获得检测结果，为简便、快速地检测小反刍兽疫病毒带来便利。
【技术实现步骤摘要】
【专利说明】
本专利技术涉及微生物检测
，具体说是涉及一种快速、可视化并且可实时定 量检测小反刍兽疫病毒（PPRV)的逆转录环介导等温扩增试剂盒及其应用。
技术介绍
小反会兽疫（pestedes petits ruminants, PPR)，是由小反会兽疫病毒（PPRV) 引起的一种急性、烈性、接触性传染病，主要感染山羊、绵羊等小反刍兽，特别是山羊高度易 感，野生动物偶然发生，感染率和死亡率高达100%和90%。OIE曾将该病例为发病必须报告 的A类动物传染病，我国将其列为I类动物疫病，一旦发现必须采取紧急严厉的措施进行 控制和扑灭。在我国周边的老挝、孟加拉国、印度、尼泊尔、俄罗斯、巴基斯坦和緬甸等国家 大规模暴发疫情，对我国养羊业构成了严重威胁。2007年7月，我国西藏日土县发生PPR疫 情，虽然及时采取有效措施扑灭了这次疫情，但这些年我国的一些省份都有小反刍兽疫阳 性病例的报道，这提醒我们要对该疾病持续监测，防止疫情再次出现。因此，建立特异、敏感 的PPR诊断技术非常重要。 目前，小反刍兽疫病毒的检测技术主要病毒分离鉴定、抗体血清学检测、病毒核酸 检测。病毒分离鉴定方法，其结果准确可靠，但该方法操作复杂，需要复杂的仪器设备和安 全级别高的实验室环境，对操作人员的技术水平要求高，此外所需时间长，以及受影响的因 素多等缺点，不利小反刍兽疫病毒的快速诊断。抗体血清学检测技术主要是采用OIE推荐 的病毒中和试验（VNT)和竞争ELISA(c-ELISA )。由于小反刍兽疫病毒和同属的牛瘟病毒， 在血清检测中具有共同的抗原，中和试验也有一定程度的交叉反应，因此二者极易混淆；竞 争ELISA也费时且要求活病毒存在。病毒核酸检测方法主要普通的RT-PCR方法和荧光 RT-PCR方法，后者的检测敏感性比前者高，虽然这两种方法较病毒分离鉴定和血清学检测 方法快速准确，RT-PCR需要昂贵的PCR仪，且在结果判定上需要进行琼脂糖凝胶电泳，容 易造成实验室污染导致出现假阳性结果，尽管荧光RT-PCR在结果判定上可直接在仪器上 读取结果，但是荧光PCR仪比普通PCR仪更昂贵，且试剂费更高，不利于基层检测以及现场 批量检测。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决基层快速、批量、准确检测小反刍兽疫（PPRV)，提供一 种方便基层简便、快捷准确地检测PPRV的试剂盒。为实现本专利技术目的所使用的技术方案 为：一种检测小反刍兽疫病毒的转录环介导等温扩增试剂盒，该试剂盒包括RT-LAMP引物、 2X反应缓冲液、酶混合物EM、荧光目视检测试剂、超纯水、阳性对照和阴性对照，所述的 RT-LAMP 引物包括外引物 F3 (SEQ ID N0:1)与 B3 (SEQ ID N0:2)、内引物 FIP (SEQ ID NO :3)与 BIP (SEQ ID NO :4)和环引物 LF (SEQ ID NO :5)与 LB (SEQ ID NO :6); 其中引物的序列分别为： F3 GACCAGAGAAGGGGTCAAAG B3 CTGCAGCCTGAAGAGTGC FIP TCTCTCCTCTGGGCCTTCCTGCTGCGATCCCAAACGGAG BIP GCCAACTGCTCCTGGACATCATTGAGCCTCACGAGGGTT LF GTGTTTGCTTTCTGTCCCTTTCTTC LB AGAGGATGAGATCTTGCGAGAGT ； 以上所述的 2X 反应缓冲液包括 Tris_HCL、KCL、MgS04、（NH4)2S04、Tween20、Betaine 和 dNTPs〇 以上所述的反应模板是使用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒提取小反刍兽疫病 毒的RNA，或者疑似小反刍兽疫病毒感染的组织的RNA。 以上所述的荧光目视检测试剂采用钙黄绿素荧光试剂，荧光试剂在反应前加入。 以上所述的 2X 反应缓冲液包括 Tris-HCL 40-50mM、KCL 20-30mM、MgSO4 16-20mM、（NH4)2SO4 20-25mM、Tween20 0· 2-0. 5 %、Betaine I. 6-3. 2M 和 dNTPs 2· 8-4 mM， 其配制方法在pH为8. 8条件下，将上述溶剂混合均匀获得。 -种检测小反刍兽疫病毒的逆转录环介导等温扩增试剂盒的应用，主要用于检测 兽医临床上疑似PPRV感染的病变组织是否存在PPRV，具体检测步骤包括： (1) 模板RNA模板的提取 (2) RT-LAMP 检测。 所述的逆转录环介导等温扩增试剂盒反应体系建立以25 μ L计， 2X反应缓冲液 12. 5 yL 酶混合物EM IyL FIP 40 pmol BIP 40 pmol LF 20 pmol LB 20 pmol F3 5 pmol B3 5 pmol 模板 5 μ L 超纯水 补足25 μ L。 以上所述的逆转录环介导等温扩增试剂盒检测过程采用实时浊度仪LA-320C进 行密闭全程监控，反应程序为63°C反应60分钟，80°C灭活5分钟。 本专利技术的实质性特点和显著的进步是： 1)特异性强 本专利技术的RT-LAMP检测试剂盒特异性检测出小反刍兽疫（PPRV)，所检测的阴性对照病 毒和水对照均无阳性结果出来，与RT-PCR检测结果一致。且操作简便、快速获得检测结果、 无需昂贵复杂的仪器，对操作人员的技术水平要求较低。 2)灵敏度高 普通的RT-PCR检测方法的灵敏度为9. 8 X 10 3 ng/ μ L，而使用本专利技术的RT-LAMP检测 方法，检测限约为9. 8 X 10 4 ng/ μ L，是普通RT-PCR的10倍。 3)耗时少 普通RT-PCR法需先进行反转录（RT)，然后再以RT产物为模板进行PCR反应，使用了两 个反应程序，扩增结束后得通过凝胶电泳的方法进行结果判定，整个过程在24小时左右才 能得出结果；而本专利技术的RT-LAMP方法可在一个反应管内同时完成两个反应程序，在20-30 分钟间出现扩增，一个小时内即可完成扩增，从病毒RNA提取到获得最终结果可在2-3小时 内完成，特别是在于批量检测，优势更明显。 4)结果判读简便 本专利技术的RT-LAMP方法在扩增结束即可判读结果，在可见光下将阳、阴性管进行比较， 通过肉眼可明显看到阳性反应呈明显浑浊，阴性反应管透明；短暂离心后，阳性反应管底部 有明显的白色焦磷酸镁沉淀物，而阴性反应管底部无沉淀物；或加入荧光染料，阳性反应管 在紫外光下呈绿色，用肉眼便可观察实验结果。不需要再进行琼脂糖凝胶电泳紫外线分析 显像或者开盖加入荧光染料进行来判读结果。 5)不造成污染 目前虽然已经建立有RT-LAMP显色法用于检测小反刍兽疫病毒，但显色法只能是反应 结束后开盖加入荧光染料进行显色反应，观察是否有显色来判读试验结果，或者通过跑电 泳的方法进行结果判定，开盖检测容易造成气溶胶产物污染实验室。而本专利技术的RT-LAMP 荧光目视检测方法，荧光染料是在反应前加入，避免开盖造成污染。此外，本专利技术的RT-LAMP 检测方法在结果判定上，直接通过浊度仪检测反应管的浊度值来判定结果，可不进行荧光 染料法检测结果或者进行琼脂糖凝胶电泳检测结果，不需要开盖，能有效避免污染。 5)本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测小反刍兽疫病毒的逆转录环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括RT‑LAMP引物、2×反应缓冲液、酶混合物EM、荧光目视检测试剂、超纯水和反应模板，所述的RT‑LAMP引物包括外引物F3（SEQ ID NO：1）与B3（SEQ ID NO：2）、内引物FIP（SEQ ID NO：3）与BIP（SEQ ID NO：4）和环引物LF（SEQ ID NO：5）与LB（SEQ ID NO：6）；其中引物的序列分别为：F3 GACCAGAGAAGGGGTCAAAG B3 CTGCAGCCTGAAGAGTGCFIP TCTCTCCTCTGGGCCTTCCTGCTGCGATCCCAAACGGAGBIP GCCAACTGCTCCTGGACATCATTGAGCCTCACGAGGGTTLF GTGTTTGCTTTCTGTCCCTTTCTTCLB AGAGGATGAGATCTTGCGAGAGT；所述的2×反应缓冲液包括Tris‑HCL、KCL、MgSO4、(NH4)2SO4、Tween20、Betaine和dNTPs。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李军，冯世文，彭昊，潘艳，陶立，马春霞，陈泽祥，杨威，胡帅，钟舒红，禤雄标，谢永平，谢宇舟，柳锋，许力干，
申请(专利权)人：广西壮族自治区兽医研究所，
类型：发明
国别省市：广西;45
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