用于检测埃博拉病毒的RPA试剂盒、其专用引物和探针及其用途制造技术

本发明专利技术提供了用于检测埃博拉病毒的RPA检测试剂盒、其专用引物、探针及其在埃博拉病毒检测中的用途。所述试剂盒、其专用引物和探针是给予埃博拉病毒NP基因保守序列设计的，所述埃博拉病毒NP基因保守序列具有SEQ ID NO.1所示的寡核苷酸序列。研究结果表明，本发明专利技术可特异、灵敏、快速地检出样本中的埃博拉病毒。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，涉及埃博拉病毒的分子生物学，特别涉及用于检测埃 博拉病毒的RPA试剂盒及其专用引物和探针与其在检测埃博拉病毒中的应用。
技术介绍
埃博拉病毒能引起一种在人类和灵长类动物中传播的急性传染病，称之为埃博拉 出血热。人感染埃博拉病毒后的潜伏期为3-21天，发病初期患者呈现出与一般流感相似的 高热、头痛等症状，随后病情迅速进展恶化，表现为出血、多器官衰竭及休克样综合症。埃博 拉病毒属于丝状病毒科，包含5个亚型，其中四种可引起人类感染，致死率可高达90%。此 外，目前世界上还没有针对埃博拉的有效的治疗方法和疫苗。这使埃博拉病毒被归为生物 安全四级病原微生物和A类生物威胁病原体，世界卫生组织已将其列为对人类危害最严重 的传染病之一。2014年，西非各国埃博拉病毒感染的疫情爆发，尤以塞拉利昂、利比里亚等 国甚为严重。因此，建立快速有效的埃博拉病毒的检测方法对于埃博拉病毒感染的防控具 有重要的现实意义。 目前，埃博拉病毒的实验室诊断主要采用RT-PCR的核酸检测方法。对于埃博拉病 毒的诊断来说，RT-PCR方法虽然是一种敏感、特异的检测方法，但是RT-PCR方法检测所需 时间长，在疫情现场无法使用。埃博拉疫情的暴发主要集中在非洲等贫困国家和地区，缺乏 健全的医疗保障体系，甚至连最基本的医疗资源都无法保障。而且RT-PCR检测过程包括复 杂的核酸提取步骤，并且需要依赖特殊且价格昂贵的热循环仪来完成扩增过程，使其很难 在设备先进的实验室之外进行操作，且需要较长时间才能得出结果，从而限制其应用。因 此，急需建立一种快速又简便的埃博拉病毒现场检测方法。 近几年中，若干恒温核酸扩增技术得到快速发展，如依赖于核酸序列的扩增技 术（NASBA)、滚环扩增技术（RCA)、环介导等温扩增技术（LAMP)和重组酶聚合酶扩增技术 (RPA)等。与传统PCR技术相比，核酸等温扩增可以摆脱传统的PCR仪，在短时间内得到准 确的检测结果。然而，针对埃博拉病毒确定出适宜的方法，还需要技术人员做大量和深入的 研究，目前尚无明确可借鉴的思路和结果。
技术实现思路
本专利技术提供用于检测埃博拉病毒的RPA试剂盒、其专用引物及探针，以实现埃博 拉病毒的快速检测。 基于对多种恒温核酸扩增技术的分析比较，确定本专利技术检测埃博拉病毒以RPA技 术为基础。重组酶聚合酶扩增（Recombinase Polymerase Amplification, RPA)是基于重 组酶聚合酶介导的扩增原理，模拟体内DNA复制的酶反应过程，依赖特定的酶和蛋白组合 (重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶）对DNA模板进行扩增，可在39 °C左右的恒温条件下， 20分钟内完成扩增反应。对硬件设备的要求很低，特别适合用于体外诊断、食品安全、生物 安全等领域。由于不需要温控设备，RPA可以真正实现便携式的快速核酸检测。而且RPA 还用不着复杂的样品处理，适用于无法提取核酸的实地检测。与其他核酸等温扩增技术相 比，RPA技术具有如下优点：RPA可以指数扩增，并可设计序列特异性探针来实时检测扩增 产物，荧光信号可以通过便携式扫描设备读取；寡核苷酸设计简单，所需要的靶序列保守区 域与PCR引物及探针设计一致；RPA反应试剂还可以干粉颗粒形式提供，方便保存运输及开 展现场检测。 因此，本专利技术的一个目的是提供的用于检测埃博拉病毒的RPA引物，所述引物是 根据埃博拉病毒NP基因保守序列设计的，用于埃博拉病毒的定性检测；所述埃博拉病毒NP 基因保守序列是含有185个碱基的核苷酸片段，具有SEQ ID NO. :1所示的寡核苷酸序列。 优选地，所述引物包括正向引物（EB0-RPA-F2)和反向引物（EB0-RPA-R2)共两条， 其序列分别如序列表中SEQ ID NO. :2和SEQ ID NO. :3所示。 本专利技术的第二个目的是提供用于检测埃博拉病毒的探针，该探针是根据埃博拉病 毒NP基因保守序列设计的，用于埃博拉病毒的定性检测；所述埃博拉病毒NP基因保守序列 是含有185个碱基的核苷酸片段，具有SEQ ID NO. :1所示的寡核苷酸序列。 优选地，所述探针的长度为46~52bp，其中5'端至少30bp，3'端至少15bp。 优选地，所述探针由5'端序列、荧光基团标记的T、四氢呋喃（THF或叫dSPACER)、 淬灭基团标记的T、3'端序列及3'端封闭物几部分组成。 优选地，所述探针具有SEQ ID NO. :4所示的寡核苷酸序列，且在探针中第32位的 核苷酸T和第33位的核苷酸T上分别标记有荧光基团和淬灭基团，两基团之间有一个脱碱 基位点（THF)(修饰后的探针序列如表1的EB0-RPA-P)。当其被核酸外切酶识别切割后，使 两基团分离而产生荧光信号。 任何荧光基团均可，常用的为FAM(羧基荧光素）或TAMRA(羧基四甲基罗丹明）； 淬灭基团为BHQ (黑洞淬灭基团）。常规荧光基团优选FAM，淬灭基团优选BHQl。 更优选地，所述探针可通过在探针3'端加适当修饰基团如：C3-间臂、磷酸基、生 物素-TEG或氨基来防止聚合酶催化的延伸反应，使探针更稳定。 本专利技术的第三个目的是提供了用于埃博拉病毒快速检测的RPA试剂盒，所述试剂 盒包括上述的RPA引物和探针。 为了方便检测，所述试剂盒还可以包括含有埃博拉病毒NP基因保守序列的阳性 质粒，所述阳性质粒含有如序列表中SEQ ID NO :1所示的埃博拉病毒NP基因保守序列。 优选地，所述试剂盒包括以下用于50 μ L的RPA反应体系的试剂，所述试剂包括： 上述正向引物和反向引物各20pmol、上述探针5pmol。 为了方便检测，所述试剂盒也可以包括阴性对照、RPA检测所需要的酶、缓冲液体 系和/或镁离子，所述阴性对照为不含埃博拉病毒NP基因保守序列的RPA反应体系。 优选地，50yL的RPA反应体系如下：上述正、反向引物各2yL(10ymol/L)、上述 探针0. 5 μ L (10 μ mol/L)、DNA模板1 μ L、去离子水12. 5 μ L、缓冲液29. 5 μ L、醋酸镁溶液 2. 5 μ L，加入含有冻干酶粉的0. 2mL反应管。其中冻干酶粉来自TwistAmp exoRT试剂盒 (exo代表Exonuclease III。下同），以含有冻干酶粉的反应管形式提供，缓冲液也由Twist 试剂盒直接提供；DNA模板浓度因所测样品不同而不同。 本专利技术还提供了上述引物、探针或试剂盒在埃博拉病毒检测中的应用。 本专利技术所述的应用，包括如下步骤： (1)以待测样品基因组DNA为模板，在所述引物的引导和所述探针标记下进行RPA 反应； (2)反应结束后进行结果判定：用RPA荧光检测仪进行检测，曲线上升的样本判定 为阳性结果；曲线没有上升的判定为阴性结果。 优选地，本专利技术所述的应用，包括如下步骤： ⑴扩增试剂准备及加样：将正反向引物各2yL(l〇ym〇l/L)、探针 0· 5 μ L(K) μmol/L)、样本 1 μ L、无 DNase 和 RNase 水 12. 5 μ L 和 29. 5 μ L 缓冲液到含有冻 干酶粉的〇. 2mL的TwistAmp RT exo反应管中。然后将2. 5 μ L醋酸镁溶液加本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于检测埃博拉病毒的RPA引物，是根据埃博拉病毒NP基因保守序列设计的，所述埃博拉病毒NP基因保守序列具有SEQ ID NO.1所示的寡核苷酸序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈泽良，刘超，杨明娟，柯跃华，汪舟佳，黄留玉，杜昕颖，王雪松，
申请(专利权)人：中国人民解放军疾病预防控制所，
类型：发明
国别省市：北京;11