本发明专利技术提供了具有内酯酶活性的突变的极端嗜热PTE，其衍生自对应于SEQ ID NO:1的共有序列的极端嗜热磷酸三酯酶，所述突变的PTE包含在55个假定的位置处选择的至少一个突变，并且所述突变的PTE具有增强的性质。此外，本发明专利技术提供了包含突变的极端嗜热PTE的组合物及其用途，尤其是作为有机磷化合物的生物清除剂或者作为使用内酯进行通讯的细菌的群体猝灭剂的用途。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】具有增强特性的火山鬃菌属磷酸三酯酶样内酯酶（PLL)及 其用途 本专利技术涉及具有增强特性的火山鬃菌属磷酸三酯酶样内酯酶（Vulcanisaetal Phosphotriesterase-Like Lactonase) (PLL)及其用途，尤其是作为有机磷化合物的生物 清除剂或者作为使用内酯进行通讯的细菌的群体猝灭剂（quorum quencher)。 有机磷酸酯（OP)杀虫剂已经成为目前可以利用的最广泛使用的杀虫剂。在农业 上、家庭中、公园和兽医实践中，使用0P。由于大部分的这些化合物抑制了一些酯酶，所以暴 露于OP可以通过多个途径导致严重的毒性。OP不可逆地抑制乙酰胆碱酯酶（哺乳动物神 经系统的一种重要的酶），导致所有脊椎动物严重的损害。酶功能的损失导致乙酰胆碱在肌 体的不同区间中累积，从而导致肌肉收缩、瘫痪和呼吸抑制。肺分泌增加伴有呼吸衰竭是有 机磷酸酯中毒而导致死亡的通常原因。 在第二次世界大战之前，军队也研发出一些0P。对毒性改善和/或稳定性提高的 OP的发现导致化学战剂（CWA)的研发，例如沙林、梭曼、塔崩或VX。此外，OP杀虫剂（与CWA OP相比，容易获得，但是毒性不那么低）构成了人群的重要危险。面对这些增加的威胁，解 毒剂的研发便更迫切了。 由于OP的疏水性，其通过吸入、消化和皮肤渗透而高效地吸收。中毒的发生取决 于化合物的吸收速率。根据接触的方法，急性OP中毒的症状在暴露过程中或暴露过程后， 在几分钟至几小时内发展。通过吸收而暴露导致毒性症状最快地出现，然后是胃肠道途径， 最后是皮肤途径。 保护性外套和面具并不总是提供针对OP的有效保护。在通过OP污染皮肤、衣物 或毛发而中毒的患者中，必须使用手术皂或洗衣去污剂来进行去污过程。治疗高度污染的 人得施用阿托品或安定，其在具有毒蕈碱受体的终末器官中，拮抗过量浓度的乙酰胆碱的 作用。不幸的是，阿托品对烟酸作用是无效的，烟酸样作用在严重中毒的情况下具体为肌无 力和呼吸抑制。当在中毒后快速给药磷定（一种胆碱酯酶活化剂）时，其减轻OP中毒的烟 酸以及毒蕈碱作用。使用此类化合物对沙林（一旦被吸入，其保持了极快速的作用）是无 效的。此外，清洁气道及改善组织氧化也是极有帮助的。 尽管上述技术形成了预防中的一些进展，但是现有的对这些中毒的保护以及治疗 仍然是不令人满意的。 在90年代早期，在几种细菌中识别了最初的OP水解酶（Cheng et al. , 1993, Appl. Environ. Microbiol. ,59:3138-3140, Raveh et al.,1993,Biochem Pharmacol.，45:2465-2474)。丁酰胆碱酯酶（BChE)-和乙酰胆碱酯酶（AChE)-基OP生物 清除剂被认为是潜在的化学计量陷阱。不幸的是，由于它们与OP的低化学计量结合能力， 所以需要巨大量的BChE或AchE来治愈中毒的个体。这导致不成比例地且非常昂贵地使用 这些酶。 统称为磷酸三酯酶（PTE)的一些其他微生物酶显示对于具有P-O或P-S键的有机 磷化合物的偏好。这些酶是氨基水解酶超级家族的成员，是催化水解具有不同化学特性的 广泛化合物（磷酯、酯、氨基化合物等）的酶。在土壤细菌中分离出它们的编码基因 opd(有 机磷酸盐降解基因），其中所述的细菌例如有缺陷假单胞菌（Pseudomonas diminuta)， 也称为缺陷短波单胞菌（Brevundominas diminuta) (Munnecke et al.，1976, Appl. Environ. Microbiol. ,32:7-13);产黄菌属（Flavobacterium)的菌种（Sethunathan et al.，1973, Can J Microbiol, 19:873-875);和放射形土 壤杆菌（Agrobacterium radiobacter) (Horne et al.，2003，FEMS Microbiol Lett, 222:1-8)，此外，在古生菌中还 识别出类似于 opd 的基因 （Merone et al·，2005, Extremophiles, 9:297-305) 〇 内酯是细菌合成的信号传导分子，从而允许它们用于检测群体的密度。这些细胞 至细胞的通讯的过程称为群体感应（QS)，并且公知地，用于调控细菌的许多关键生物学功 能，包括生物膜形成（Popat et al.，2008，British Medical Bulletin, 87:63-75)。QS 与 毒力之间的连接成为许多细菌感染的发病机理的中心，包括铜绿假单胞菌（P. aeruginosa) (Sakuragi et al.，2007, J Bacteriol, 189:5383-5386)，而且还包括鲍曼不动杆菌 (A.baumanii) (Stacy et al·，2012, ACS Chem Biol, 7 (10) :1719-1728),伯克霍尔德氏菌 属物种（Bulkolderia sp.) (McKeon et al.，2011，J Infect Dis，Feb 1;203(3):383_92)， 弧菌属（Vibrio)的菌种（Augustine et al·，2010, Arch Microbiol 192(12):1019-1022) 或者胡萝卜欧氏杆菌（E.caratovora) (Dong et al·，2001，Nature, 411:813-817)。干 扰QS系统（也称为群体猝灭）是在植物和动物中控制细菌疾病的有前途的方法（Dong et al.，2001，nature, 411:813-817)。N-酰基高丝氨酸内酯（AHL)为介导许多革兰氏 阴性细菌和一些古细菌有机体的细菌通讯的分子（Zhang et al.，2012, ISME J.，Jul; 6(7):1336-44)。其传统上调节感染和毒力功能。这些分子在介质中累积，从而达到可 以改变细菌转录图谱的某一阈值（Hentzer et al.，2003，Embo J, 22:3803-3815)。通 过水解AHL，内酯酶样PLL可以猝灭细菌之间AHL介导的通讯，如同人类对氧磷酶（Ma et al·，2009,Appl Microbiol Biotechnol, 83:135-141)或 AiiA 内酯酶（Dong et al·，2001，Nature, 411:813-817)中可见。由于PLL的双重催化活性（内酯酶和磷酸三酯 酶），PLL构成了作为群体淬灭试剂或OP生物清除剂，用于生物技术用途的有高度吸引力的 候选物。 最近，在日本和俄罗斯，已经发现了属于泉古菌门（Crenarchaeota)的新的嗜 热细菌。在火山地区的温泉中发现了火山鬃菌属的菌种。为了了解这种古细菌的生理 特性及它们的可能的生态作用，对目前已知的2种火山鬃菌属菌种（V. distribute和 V.moutnovskia)的完整基因组进行测序（Mavromatis et al·，2010, Stand Genomic Sci.; 3(2):117-25/Gumerov et al.，2011，J Bacte本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种具有内酯酶活性的突变的极端嗜热磷酸三酯酶(PTE)，其衍生自对应于SEQ ID NO:1的序列或者与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少70％的一致性的极端嗜热PTE，所述突变的PTE包含选自以下的至少一个突变，其中SEQ ID NO:1的以下位置处的氨基酸被任何其他的天然或非天然的氨基酸取代：‑位置29处的缬氨酸L的取代，‑位置99处的酪氨酸Y的取代，‑位置101处的酪氨酸Y的取代，‑位置225处的精氨酸R的取代，‑位置265处的色氨酸W的取代。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：E·查波里雷，M·埃利亚斯，J·海波洛特，D·劳特，
申请(专利权)人：国家科研中心，艾克斯马赛大学，
类型：发明
国别省市：法国;FR
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