生物流体中脱落或循环的肿瘤细胞的检测方法技术

本发明专利技术涉及使用被标记的垂体腺苷酸环化酶活化肽或血管活性肠肽检测生物流体中脱落或循环的肿瘤细胞的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】 专利技术介绍 本申请要求2013年2月15日提交的美国临时申请US61/765, 329的优先权的权 益，其内容以其整体通过参考而引入本文中。 本专利技术得到美国国立卫生研究院的政府资助，授予的合同号为CA157372-01A1。政 府对于本专利技术享有某些权利。
技术介绍
有证据表明，在出现临床症状前的早期疾病阶段，原发癌开始脱落肿瘤细胞进 入循环。恶性肿瘤的特征是它们入侵相邻组织的能力。整体而言，直径1mm的肿瘤血管 化，动物研究表明肿瘤中存在的多达4%的这种细胞能够在24h的时间段内脱落进入循环 (Butler&Gullino(1975)CancerRes. 35 :512-516)〇 已经描述了多种分离和检测血液中肿瘤细胞的方法。例如，US6, 190, 870教导了 免疫磁珠分离随后流式细胞计数。然而，还是没有可视化的样品分析。US6, 197, 523描述 了对100μ1血液样品中的癌症细胞进行计数。该方法使用毛细管显微镜对发现的细胞的 识别进行确认。进一步地，US6, 365, 362描述了对样品进行免疫磁珠富集和分析以确定血 液中的肿瘤细胞的方法。根据该专利的方法，对于存在核酸和其它标记的分离细胞进行标 记，这使得在分析过程中排除非目标样品成分。W002/20825描述了通过粘附基底来计数肿 瘤细胞。简而言之，用将与具有转移潜能的癌细胞结合的特定粘附分子涂覆基底。然后分 析基底上捕获细胞的存在和类型。 近来药物开发的方法集中于了解疾病的发生以及在分子水平控制疾病的生物医 药途径。先前的研究表明VPAC(血管活性肠肽（VIP)和垂体腺苷酸环化酶活化肽（PACAP) 的总称）受体在BC细胞上以高密度过表达（Reubi，等.（2000)CancerRes. 60(11): 3105-3112)。VPAC受体涉及细胞增殖、细胞分化，以及BC细胞的存活。在基质、正常细胞 和良性肿块上，只表达少量的VPAC受体（Reubi，等·（2000)同上；Zia，等.（1996)Cancer Res.56(15) :3486-89 ；Leyton,等·（1999)BreastCane.Res.Treat. 56(2) : 177-186 ; Moody&GozesI(2007)Curr.Pharm.Des. 13(11) ：1099-1104 ；Valdehita,等·（2010) Peptides31 (11) :2035-2045 ;Valdehita，等·（2012)M〇1.CellEndocrinol. 348(1): 241-246)〇 在临床前环境中，已经开发和分析了对于VPAC受体具有高度亲和性的放射性标 记生物分子（Chakder&Rattan(1993)J.Pharm.Expt.Therapeut. 266 :392-399 ;Thakur， 等·（2000)J.Nucl.Med. 41 :107-110 ;Pallela，等·（1999)J.Nucl.Med. 40(2) :352-360 ; Kolan，等·（1997)J.Label.Comp.Radiopharmaceut. 40 :455-457 ;Thakur，等·（2004) J.Nucl.Med. 45:1381-1389 ;Zhang，等·（2007)Reg.P印tides144:91-100 ;Thakur(2009) Semin.Nucl.Med. 39 :236-246 ;Thakur，等·（2010)J.Nucl.Med. 51 :106-111 ;Zhang， 等.（2008)J.Nucl.Med. 49 :112-121;US6, 855, 308)。基于其对于VPAC受体的高度亲和性， 生成并评价了通过用Tc99m(t1/2-6小时，y-140keV)放射性标记修饰的肽构建物的对于受 体亲和性（Kd)、受体特异性、体内稳定性和组织分布（Thakur，等.（2000)同上；Pallela， 等.（1999)同上；Kolan，等.（1997)同上；Thakur，等.（2004)同上；Zhang，等.（2007)同 上；Thakur(2009)同上；Thakur，等.（2010)同上；Zhang，等.（2008)同上）。此外，用发射 0+(19%，656kev)的Cu-64(t1/2-12. 8小时）对肽进行标记，用于正电子发射计算机断层 显像（PET)，以N2S2作为螯合剂。已经检测了荷T47D人类BC的无胸腺裸鼠中的Kd值、组 织分布研究、受体阻断研究、受体亲和性和体内的稳定性（Thakur，等.（2004)同上；Zhang， 等.（2007)同上；Thakur(2009)同上；Thakur，等.（2010)同上；Zhang，等.（2008)同上）。 在产生的化合物中，CU-64-TP3805不仅成像了无胸腺裸鼠体内的所有异种移植人类BC(注 射后24h肿瘤吸收6. 35±1. 28%ID/g)，而且该化合物还定位了转基因MMTVneu鼠（η= 9)中所有（η= 8)自发生长的BC(5个可见，1个不可见，以及2个转移）病变（Thakur， 等.（2010)同上）。此外，对于两个对VPAC1受体表达可忽略不计的病变，CU-64-TP3805PET 图像是正常的。通过组织病理和使用RT-PCR检测的表达的VPAC1受体确认了八个恶性病 变（Thakur，等.（2010)同上）。 专利技术概述 本专利技术提供了检测脱落或循环的肿瘤细胞的方法、和通过将生物流体与被标记的 垂体腺苷酸环化酶活化肽（PACAP)或血管活性肠肽（VIP)接触并测定PACAP或VIP与生物 流体中脱落或循环的肿瘤细胞的结合而诊断癌症的方法。在一个实施方式中，生物流体是 血液、尿液或脑脊液。【具体实施方式】 现在已经发现，标记的垂体腺苷酸环化酶活化肽（PACAP)能够结合VPAC1受体并 检测血液或尿液中存在的肿瘤细胞。标记的肽能够检测5个细胞/ml样品的浓度下的细胞 并正确地识别和区分肿瘤细胞与污染的上皮组织细胞和白细胞。在检测肿瘤细胞中使用这 种标记的肽简单、高效并且不需要昂贵的设备或培训。 因此，本专利技术提供了使用标记的PACAP或血管活性肠肽（VIP)检测生物流体中的 肿瘤细胞，并诊断癌症的方法，这两种肽能够结合VPAC1受体。根据本专利技术，PACAP意在表 不具有序列His-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Lys-Gln-Me t-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-Gly-Lys-Arg-Tyr-Lys-Gln-Arg-Val-Lys -Asn-LyS(SEQIDNO:1)的肽，或者其29-37个氨基酸残基片段。在某些实施方式中，29-37 个氨基酸残基片段包括SEQIDN0 :1的PACAP的N-末端29-37个氨基酸残基。在特别的 实施方式中，PACAP具 Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu(SEQIDNO：2本文档来自技高网...

【技术保护点】
检测脱落或循环的肿瘤细胞的方法，其包括将生物流体与被标记的垂体腺苷酸环化酶活化肽(PACAP)或血管活性肠肽(VIP)接触，并测定PACAP或VIP与生物流体中脱落或循环的肿瘤细胞的结合，从而检测脱落或循环的肿瘤细胞。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：马修斯·L·塔库尔，莱昂纳德·G·戈梅拉，
申请(专利权)人：托马斯杰弗逊大学，
类型：发明
国别省市：美国;US