一种用于呼肠孤灭活疫苗的佐剂及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种用于呼肠孤灭活疫苗的佐剂及其制备方法，该佐剂创新性的引入了ISCOM基质成分，可刺激机体产生较强的细胞免疫和体液免疫，具有更好的免疫促进作用，延长疫苗免疫保护期。当本发明专利技术佐剂用于呼肠孤灭活疫苗制备时，剂型为油包水(W/O)型，由于成分配方的合理化设计使得利用该佐剂制备的呼肠孤灭活疫苗具有较好的稳定性，在2～8℃条件下保存18个月仍保持性状稳定。此外，实际应用发现，以该佐剂制备的呼肠孤灭活疫苗接种鸡后无局部或全身性不良反应，安全性可靠，而且较现有技术佐剂制备的呼肠孤灭活疫苗具有更好的免疫效果。本发明专利技术以创新性的技术改进实现了突出的技术效果，同时成本较低，易于实现，因此具有突出的推广前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及兽用疫苗
，具体涉及一种用于呼肠孤灭活疫苗的佐剂及其制 备方法。
技术介绍
呼肠孤病毒具是具有分节段的双链RNA基因组的一类病毒，该病毒分布极广，易 在禽类间爆发流行，致死率较高，同时还可以突破宿主屏障，感染包括人类在内的哺乳动 物，因此该疾病对人类健康和经济发展具有严重危害。呼肠孤宿主广泛，因此防控工作具有 较大难度，除了保证适当的卫生条件和隔离措施之外，接种疫苗是控制呼肠孤流行的关键 性措施。现有技术中，尽管呼肠孤疫苗早已形成产品，但仍存在着诸如保护效力不足、需多 次免疫才能起效、成本较高等技术缺陷，从而难以满足使用需求。 为了提升疫苗的免疫效果，现有技术的研究者从多方面进行了努力，例如开发免 疫效果更好的抗原物质、在接种疫苗的同时饲喂免疫促进剂等。佐剂（adjuvant)是与抗原 混合后注射于生物体内、能非特异性改变或增强机体对该抗原的特异性免疫应答的物质， 因此开发适宜的疫苗佐剂将有助于提升疫苗质量，增强免疫效果。 现有技术中，免疫佐剂多选用白油佐剂、氢氧化铝佐剂、类脂佐剂和蜂胶佐剂等， 其中白油佐剂被认为有助于强化疫苗免疫效力，目前应用较为广泛。白油佐剂常用剂型包 括水包油（0/W)、水包油包水（W/0/W)、油包水（W/0)三种，其中油包水（W/0)型应用最为普 遍，但也存在一定的技术缺陷，例如其粘度较高、注射困难；同时由于疫苗中白油含量相对 较高，常常导致严重的接种副反应，形成无菌性化脓损害和接种部位周围的肉芽肿，可产生 外部可见的浮肿、肿胀、硬结和坏死；此外有研究认为该剂型的佐剂接种后可能在接种部位 形成残留，从而带来安全隐患。
技术实现思路
本专利技术旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种用于呼肠孤灭活疫苗的佐剂及其 制备方法，以解决现有技术的佐剂对呼肠孤灭活疫苗免疫效力促进作用较低的技术问题。 本专利技术要解决的另一技术问题是现有技术的油包水型佐剂易使得疫苗注射后产 生副作用。 本专利技术要解决的再一技术问题是现有技术的佐剂不稳定、易随时间推移发生性质 改变。 为实现以上技术目的，本专利技术采用以下技术方案： -种用于呼肠孤灭活疫苗的佐剂，该佐剂分为油相和ISC0M基质两部分，其中所 述油相包括以下成分：注射级白油80~85% (w/w)，span806~8% (w/w)，吐温806~8% (w/w);所述ISC0M基质中包括以下成分：QuilA0. 2~5mg/ml，胆固醇0. 2~5mg/ml，左旋 味挫3~8mg/ml。 优选的，所述QuilA的含量是1~5mg/ml。 优选的，所述胆固醇的含量是1~5mg/ml。 本专利技术同时还提供了上述佐剂的制备方法，该方法包括以下步骤： 1)取配方量的QuilA、左旋咪唑、胆固醇溶于PBS缓冲液中得到ISC0M基质； 2)取配方量的注射级白油，灭菌后向其中加入配方量的span80和吐温80,乳化后 即得到油相。 在此方法基础上优选的，步骤2)是：取配方量的注射级白油，灭菌后向其中加入 配方量的span80,以60~100r/min的转速搅拌4~6min，而后在搅拌状态下向其中加入 吐温80,以60~100r/min的转速搅拌4~6min，即得到油相；更优的，上述两次搅拌转速 均为80r/min、揽摔时间均为5min。 本专利技术的佐剂在疫苗的制备过程中可以是通过以下方法使用的：将疫苗抗原溶液 与本专利技术佐剂的ISCOM基质混合作为水相，将该水相与本专利技术佐剂的油相按（1:1)~（1:3) (v/v)比例混合，即得到疫苗。 在以上技术方案中，ISCOM(immunostimulatingcomplex)基质是一种含有抗原成 分的免疫刺激复合物，称为免疫刺激复合物基质，由QuilA(皂苷活性成分）、胆固醇等制备 得到，其特点在于能有效地活化辅助型T细胞和细胞毒性T细胞，促进细胞免疫应答，尤其 是Thl型细胞免疫应答，其次，ISC0M基质通常人们将其应用到活疫苗中，本专利技术创造性地 将其应用到灭活疫苗中，实验证实，能更有效地激活免疫，显著提高了全病毒的抗原呈递及 疫苗的持续性。左旋咪唑是一种广谱驱虫药，同时研究发现其具有明显的免疫调节作用。 本专利技术用于呼肠孤灭活疫苗的佐剂创新性的引入了ISC0M基质成分，提升了免疫 促进效果，可刺激机体产生较强的细胞免疫和体液免疫，具有更好的保护作用，延长疫苗免 疫保护期。当本专利技术佐剂用于呼肠孤灭活疫苗制备时，剂型为油包水（W/0)型，由于成分配 方的合理化设计使得利用该佐剂制备的呼肠孤灭活疫苗具有较好的稳定性，在2-8°C条件 下保存18个月仍保持性状稳定。此外，实际应用发现，以该佐剂制备的呼肠孤灭活疫苗接 种鸡后无局部或全身性不良反应，安全性可靠，而且较现有技术佐剂制备的呼肠孤灭活疫 苗具有更好的免疫效果。本专利技术以创新性的技术改进实现了突出的技术效果，同时成本较 低，易于实现，因此具有突出的推广前景。【具体实施方式】 以下将对本专利技术的【具体实施方式】进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在 以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。除有定义外，以下实施例中所 用的技术和科学术语具有与本专利技术所属领域技术人员普遍理解的相同含义。 实施例1 (1)佐剂油相的制备 油相是向按照百分比（白油：span80 = 17:1)组成的混合液中加入硬脂酸铝，其 加入量为每l〇〇ml混合液加入2g硬脂酸铝。120°C、20min高温蒸汽灭菌，室温保存备用。 (2)佐剂ISC0M基质的制备 分别称取QuilA100mg、胆固醇100mg、左旋咪唑500mg，用lOmlPBS溶解混匀得 10倍浓度的ISC0M基质。 (3)呼肠孤灭活病毒液的制备 按照《兽用生物制品质量标准汇编》（2012)，相关要求制备灭活的呼肠孤病毒抗原 水溶液，灭活前每〇. 2ml病毒液病毒含量应3 107'°LD5。。 (4)呼肠孤疫苗的制备 在无菌操作情况下，将上述⑵中制备的ISC0M3ml与⑶中制备的呼肠孤灭活病 毒液15g放入50ml的烧杯中，混匀；另取（1)中制备的油相加热至30°C，取13g也放入该 烧杯中，同时加入磁力转子置磁力搅拌器（含加热功能）上进行搅拌乳化，转速为2000转 /min，温度为30°C，搅拌30min，即成，命名为呼肠孤疫苗A。 同法不加ISC0M基质制作白油对照疫苗当前第1页1 2 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于呼肠孤灭活疫苗的佐剂，其特征在于该佐剂分为油相和ISCOM基质两部分，其中所述油相包括以下成分：注射级白油80～85％(w/w)，span806～8％(w/w)，吐温806～8％(w/w)；所述ISCOM基质包括以下成分：QuilA0.2～5mg/ml，胆固醇0.2～5mg/ml，左旋咪唑3～8mg/ml。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：吴全忠，王寿山，米娜，刘恒权，高小光，张忠江，
申请(专利权)人：天津佐沐生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12