本发明专利技术公开了一种重组人源化免疫毒素Gigantoxin-4-4D5 scFv，该免疫毒素包含了抗人表皮生长因子受体-2(HER-2)单链抗体4D5scFv和海葵溶细胞素Gigantoxin-4，由两者融合表达形成。本发明专利技术利用单链抗体对HER-2高表达肿瘤的靶向性和Gigantoxin-4对细胞膜裂解作用从而对肿瘤起到特异的杀伤作用。本发明专利技术的免疫毒素具有严格的靶向性，避免对正常细胞的伤害；不需经过细胞内化和转运就可以起到杀伤肿瘤作用；不易产生耐药性；制备方法简单，抗肿瘤效果明显。本发明专利技术的免疫毒素具有很好的应用前景，可以用于高表达HER-2的肿瘤细胞的治疗。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程技术，特别涉及一种重组免疫毒素 Gigantoxin-4-4D5 scFv 及其制备方法和用途。
技术介绍
恶性肿瘤已成为威胁人类健康的最重要疾病之一，特别是在我国，肿瘤已经超过 心血管疾病成为造成最多死亡人数的头号杀手。 目前治疗肿瘤的方法主要为化疗和放疗，但是常规放化疗基本不具备针对肿瘤的 特异性，放化疗在破坏癌细胞的同时对正常细胞也产生杀伤作用，从而对人体产生很大的 毒副作用，同时还会导致宿主免疫系统的破坏，放化疗后易引起多种并发症而且肿瘤易复 发，常规放化疗的特点造成肿瘤治疗的疗效和预后都不理想。肿瘤分子靶向治疗是根据肿 瘤上的分子靶点设计的药物来抑制肿瘤细胞生长、转移、清除肿瘤细胞的方法，与其它治疗 手段相比，肿瘤分子靶向治疗具有作用特异性高、范围广泛、毒副作用小等特点。 人类表皮生长因子受体2 (HER-2)属于跨膜酪氨酸激酶受体家族的成员，HER-2蛋 白通常只在胎儿时期表达，成年以后只在极少数组织内低水平表达。然而HER-2却在多种 人类肿瘤中过度表达，如乳腺癌（25-30% )、转移性导管癌（60-70% )、膀胱癌（27-63% )、 胰腺癌（31-80% )、非小细胞肺癌（13-55% )、卵巢癌（18-43% )等。 抗册1?2单链抗体（4058〇?￥)由重链可变区（￥!1)和轻链可变区（￥1^)2个抗原特 异性结合片段经过一个柔性铰链连接而成，具有较好的血清及热稳定性，并与有HER2较高 的选择性结合能力。 Gigantoxin-4是从海葵Stichodactyla gigantea提取的一种溶细胞素，能够通 过裂解细胞膜而发挥细胞毒作用。避免了其他一些毒素需通过细胞内化而带来的抗肿瘤效 率低及后续的耐药性。 目前，还没有利用抗人表皮生长因子受体2单链抗体4D5 SCFv融合海葵溶细胞素 Gigantoxin-4治疗肿瘤的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的，就是为了提供一种重组免疫毒素 Gigantoxin-4_4D5 scFv及其制 备方法和用途。 本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：一种重组免疫毒素 Gigantoxin-4_4D5 scFv，由抗 HER-2 单链抗体 4D5 scFv 和海葵溶细胞素 Gigantoxin-4 融 合表达形成。 上述的 Gigantoxin-4_4D5 scFv 运用（G4S) 3 柔性 linker 连接。 编码重组免疫毒素 Gigantoxin-4-4D5 scFv的基因，采用PCR扩增方法得到改造 后的4D5 scFv及Gigantoxin-4基因，并采用融合PCR将（G4S) 3柔性linker连接两段基 因，最后得到完整的编码Gigantoxin-4-(G4S) 3-4D5 scFv基因。 一种载体，含有Gigantoxin-4_(G4S) 3-4D5 scFv基因，该载体是在 Gigantoxin-4-(G4S)3-4D5 scFv基因前面加上了小分子泛素类修饰蛋白SUM0,促进蛋白的 可溶表达及正确折叠，并构建到含有T7启动子的PET28a(+)表达载体上。 一种含有权利要求4所述载体的宿主细胞E. coli BL21 (DE3)pLysS。 上述重组免疫毒素 Gigantoxin-4_4D5 scFv的制备方法，包括以下步骤： (1)将含有SUM0-Gigantoxin-4-4D5 scFv基因的重组大肠杆菌在37°C培养，当 OD6。。达到0. 2-1. 5时，加入终浓度为0. 05-0. 4mM的异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷， 16_37°C诱导 10_25h，异源表达 SUM〇-Gigantoxin-4_4D5 scFv，离心，破碎，取上清； (2)将步骤（1)的上清利用His标签的亲和层析分离纯化SUM0-Gigantoxin-4-4D5 scFv ； (3)将步骤（2)中的融合蛋白利用SUMO蛋白酶20-37°C酶切2-8h，再一次利用镍 柱分离纯化，收集穿出液； (4)将步骤（3)中的穿出液利用20mM磷酸二氢钠缓冲液4°C透析3次，每次至少 4h，利用羧甲基琼脂糖凝胶柱层析，并用相同pH下含有10-30mM的磷酸二氢钠的梯度氯化 钠浓度缓冲液洗脱。 重组免疫毒素 Gigantoxin-4-4D5 scFv在治疗卵巢癌SK-0V-3中的应用。 本专利技术具有以下的优点和特点： (1)传统毒素存在细胞内化问题导致抗肿瘤效率低，本专利技术所用毒素作用于细胞 膜，不存在内化问题，抗肿瘤效率高； (2)本专利技术所采用的制备方法简单可行，生产成本低； (3)本专利技术的免疫毒素主要是通过作用于细胞膜而发挥抗肿瘤作用，很难产生耐 药性。 (4)本专利技术将抗HER-2单链抗体4D5 scFv创造性地与海葵溶细胞素 Gigantoxin-4 融合，组成了一种新型的免疫毒素，能与肿瘤细胞表面的抗原结合并起到杀伤肿瘤的作用， 具有很强的特异性，毒副作用小，抗肿瘤效果明显，具有很好的应用前景。【附图说明】： 图1为重组免疫毒素的Gigantoxin-4_4D5 scFv质粒构建不意图； 图 2 为 SDS-PAGE 验证 SUM0-Gigantoxin-4-4D5 scFv 表达情况； 图 3 为 SUM〇-Gigantoxin-4_4D5 scFv 银柱纯化结果； 图4为SUM〇-Gigantoxin-4_4D5 scFv酶切后银柱纯化结果； 图5为Gigantoxin-4_4D5 scFv经离子交换层析纯化结果； 图6为纯化的蛋白卵巢癌SK-0V-3细胞的增殖抑制作用，其中，图6A为 Gigantoxin-4,图 6B 为 Gigantoxin-4_4D5 scFv ； 图7为纯化的蛋白对人胚肾293细胞（HEK-293)的增殖抑制作用，其中，图7A为 Gigantoxin-4,图 7B 为 Gigantoxin-4_4D5 scFv ； 图8为纯化的蛋白对正常人的红细胞溶血作用； 图9为检测Gigantoxin-4-4D5 scFv对HER-2表达阳性的肿瘤细胞SK-0V-3的 靶向性；其中，图9A为Gigantoxin-4作用于SK-0V-3细胞；图9B为Gigantoxin-4-4D5 scFv作用于SK-0V-3细胞；图9C为Gigantoxin-4作用于HEK-293细胞；图9D为 Gigantoxin-4_4D5 scFv 作用于 HEK-293 细胞。【具体实施方式】 图1为重组免疫毒素的Gigantoxin-4-4D5 scFv质粒构建示意图。 实施例1重组免疫毒素 Gigantoxin-4_4D5scFv的制备 本实施例1是在以下实施条件和技术要求条件下实施的： (1)构建 pET28a (+)/SUM〇-Gigantoxin-4_4D5 scFv 重组质粒 A、SUM0-Gigantoxin-4-4D5 scFv基因片段的克隆。根据各片段模版及要加入的 linker(G4S)3所设计的引物如表1所示： 表 1 用 Cl 和 C2、C3 和 B2、B3 和 M 分别以 SUM0、Gigantoxin-4、4D5scFv 为模板 PCR 出 相应片段，linker(G4本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种重组免疫毒素Gigantoxin‑4‑4D5scFv，由抗HER‑2单链抗体4D5scFv和海葵溶细胞素Gigantoxin‑4融合表达形成。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：孙爱友，吕欣欣，魏东芝，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：上海;31
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