一种利用生殖特异性启动子表达cre的重组酶载体，属于生物技术领域。本发明专利技术的目的是利用VASA基因的生殖特异性表达，来建立转基因猪模型的利用生殖特异性启动子表达cre的重组酶载体。本发明专利技术载体的构建方法是：①VASA转录起始位点上游序列扩增与纯化；②VASA转录起始位点上游序列测序；③VASA-Cre表达载体构建。本发明专利技术利用基因工程技术构建了一个生殖系统特异表达cre重组酶的质粒，并且重组质粒可以在药物压力下独立于细胞染色体外存在。该质粒可以保证在生殖系统中特异表达cre重组酶，可以与loxp相结合，进行相关生殖系统表达基因的敲除，为cre重组酶系统的发展和相关基因的研究起到积极的推动作用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
技术介绍
利用Cre/loxP系统进行条件性基因敲除是目前最有效，也是最具发展前景的基 因修饰策略。在过去的30年里，以小鼠为载体，利用Cre/loxP系统进行基因功能研究取得 了非常显著的成果。随着转基因技术的发展，利用Cre/loxP系统构建条件性基因敲除动物 模型将成为活体内研究基因功能的强大工具，也使得基因功能的研究更全面，更准确。 用基因敲除技术构建的人类疾病的小鼠模型能够很好地模仿人类疾病的发生发 展特征，为人类疾病研究提供了可靠的工具，在肿瘤研究、药物筛选等方面应用十分广泛。 不过，小鼠作为啮齿类动物，与哺乳动物在基因组特点、组织结构、器官大小等方面存在比 较大的差别，因此小鼠动物模型在某些方面并不能非常准确地为人类研究提供工具。与小 鼠相比，猪作为哺乳动物，在基因组水平、器官结构大小、生理特征、代谢过程、免疫过程等 方面都与人类更接近。此外，猪发育周期短、繁殖率高、同窝产仔数多，在转基因猪制备中， 具有较好的重复性。因此利用猪作为新的动物模型能够为人类提供更好的研究工具。 VASA基因是DEAD-box家族中的一员，它在生殖细胞增殖和分化过程中发挥着重 要作用。因为VASA基因仅能在许多生物的生殖系细胞中才会特异性表达，所以被广泛地 当作生殖细胞的分子标记物来使用，并且VASA基因在动物生殖细胞发生和生殖调控等方 面都起到了重要作用，并且还发现Vasa纯合子突变的胚胎连生殖细胞前体细胞都无法发 育形成。VASA的基因编码依赖于RNA解旋酶，而VASA还是DEAD - box家族中的一员。 DEAD-box家族蛋白参与和胞内RNA对细胞调控的作用有关，它们也控制着RNA本身在细胞 内的代谢。其中，调节RNA的转录、pre-mRNA、核内mRNA的剪切与运输；对调控蛋白质翻译 起始与细胞器基因表达情况还有RNA降解等过程也有着重要调控作用。DEAD - box家族所 具有的RNA解旋酶活性是完成基因复制、RNA转录等生命活动所必需的，并且DEAD - box 家族广泛存在于从真、原核细菌；酵母、植物到各种高等动物，如哺乳动物等的广大真核生 物当中。VASA基因在这些生物中保有较高的同源性。然而就鱼类而言，VASA是目本前已 发现的极少数几个在原始生殖细胞PGC中表达的分子标签之一，在生殖腺、生殖细胞的发 育过程中起着重要的作用。VASA在果蝇的胚胎发育中起着多重的功能。除了在极细胞(原 生殖细胞）的形成中起重要作用外，它还参与果蝇胚轴后极的决定。VASA的突变不但会导 致极细胞不能形成，还可导致胚胎腹部体节的产生异常发育。
技术实现思路
本专利技术的目的是利用VASA基因的生殖特异性表达，来建立转基因猪模型的利用 生殖特异性启动子表达ere的重组酶载体。 本专利技术载体的构建方法是： ① VASA转录起始位点上游序列扩增与纯化： 根据VASA转录起始位点上游4118 bp序列设计引物，同时分别在上下游引物5'-端引 入NheI与Seal酶切位点，以正常小型猪基因组为模板，利用Taq plus Mix扩增VASA启动 子区片段； 引物序列如下所示： VASA-F :5，GGCTAGCCACAGATTTCAAGAGAGAAAGAAATGAGG 3， VASA-R :5' GAGTACTCCCGTTCTTCATTTGACCCAAAGTCCACC 3， PCR 反应体系包括 2 X Taq plus Mix 5ul, Primer F2/R2 各 0.5ul, Temple 0.1 yg ,H2O To 10 μ I ； ② VASA转录起始位点上游序列测序： 纯化片段检测后，利用T4 DNA连接酶连接到pGM-T载体，连接反应体系包括： IOXLigase Buffer Iul;回收片段 6ul ;pGM_T Vector 0.5ul;T4 DNA ligase Iul ;H2O To 10 μ I ; ③ VASA-Cre表达载体构建： 利用4300bp猪源VASA转录起始位点上游序列驱动Cre重组酶表达的表达载体是通过 替换实验室保存的诱导性表达Cre重组酶载体pET28a-Mxl-Cre-BGHpolyA-FRT2neo中Mxl 序列完成的，构建载体为 pET28a-VASA-Cre-BGHpolyA-FRT2neo,基因序列 SEQ ID NO :1， 命名为：VASA-Cre，载体全长：12, 088 bp。 本专利技术VASA启动子区的组织特异性检测：构建了 VASA-TOM质粒，将VASA的启动 子区与红色荧光蛋白相连接，连接成功后，将VASA-TOM瞬时转染不同细胞系，并检测红色 荧光表达情况。 本专利技术利用生殖特异性启动子表达ere的重组酶载体构建转基因猪的方法， VASA-cre质粒经过ApaLI限制性内切酶酶切线性化，DNA片段回收，转染猪胎儿呈成纤维 细胞中进行阳性克隆筛选，将筛选出的阳性克隆细胞按常规进行受精卵去核显微注射和输 卵管胚胎移植。 本专利技术利用生殖特异性启动子表达ere的重组酶载体构建转基因猪的鉴定方法， 剪取出生后4天的猪耳组织，提取基因组作为PCR模板，Cre重组酶通用引物如下，扩增目 的片段长944bp : 正向引物序列：GAATTCTCAATCGCCATCTTCCAGC 反向引物序列：AAGCTTATGGCCAATCTCCTGACCG PCR条件：预变性94°C 3分钟；94°C变性30s ;55°C复性30s ; 72°C延伸30s，进行35 个循环；最后72 °C延伸5分钟。 本专利技术利用基因工程技术构建了一个生殖系统特异表达Cre重组酶的质粒，并且 重组质粒可以在药物压力下独立于细胞染色体外存在。该质粒可以保证在生殖系统中特异 表达ere重组酶，可以与Ioxp相结合，进行相关生殖系统表达基因的敲除，为ere重组酶系 统的发展和相关基因的研究起到积极的推动作用。【附图说明】 图1是VASA基因启动子区序列扩增； 图2是VASA-Cre重组质粒图； 图3是VASA-Cre重组质粒酶切鉴定； 图4是VASA-tdTOMATO表达载体的构建； 图5是转染后48 h各细胞荧光表达情况。【具体实施方式】 本专利技术载体的构建方法是： VASA转录起始位点上游序列扩增与VASA-Cre表达载体构建 VASA转录起始位点上游序列扩增与纯化 根据VASA转录起始位点上游4118 bp序列设计引物，同时分别在上下游引物5'-端引 入NheI与Seal酶切位点，以正常小型猪基因组为模板，利用Taq plus Mix扩增VASA启动 子区片段。引物序列如下所示： VASA-F :5，GGCTAGCCACAGATTTCAAGAGAGAAAGAAATGAGG 3， VASA-R :5' GAGTACTCCCGTTCTTCATTTGACCCAAAGTCCACC 3 PCR 反应体系包括 2 X Taq plus Mix 5ul, Primer F2/R2 各 0.5ul, Temple 0.1 yg ,H2O To 10 μ 1。将各组分混合后，按如下条件设置PCR反应程序：94°C : 5 min; 95°C : 30 s, 58°C :本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用生殖特异性启动子表达cre的重组酶载体，其特征在于：①VASA转录起始位点上游序列扩增与纯化：根据VASA转录起始位点上游4118 bp序列设计引物，同时分别在上下游引物5’‑端引入NheI与ScaI酶切位点，以正常小型猪基因组为模板，利用Taq plus Mix扩增VASA启动子区片段；引物序列如下所示：VASA‑F：5' GGCTAGCCACAGATTTCAAGAGAGAAAGAAATGAGG 3'VASA‑R：5' GAGTACTCCCGTTCTTCATTTGACCCAAAGTCCACC 3，PCR 反应体系包括2×Taq plus Mix 5ul, Primer F2/R2各0.5ul, Temple 0.1 μg ,H2O To 10 μl；②VASA转录起始位点上游序列测序：纯化片段检测后，利用 T4 DNA 连接酶连接到 pGM‑T 载体，连接反应体系包括：10×Ligase Buffer 1ul；回收片段 6ul ；pGM‑T Vector 0.5ul；T4 DNA ligase 1ul ;H2O To 10 μl；③VASA‑Cre表达载体构建：利用4300bp猪源VASA转录起始位点上游序列驱动Cre重组酶表达的表达载体是通过替换实验室保存的诱导性表达Cre重组酶载体pET28a‑Mx1‑Cre‑BGHpo1yA‑ FRT2neo中Mx1序列完成的，构建载体为pET28a‑VASA‑Cre‑BGHpo1yA‑FRT2neo，基因序列SEQ ID NO：1，命名为：VASA‑Cre，载体全长：12,088 bp。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：逄大欣，宋宇宁，李占军，王勇，欧阳红生，赖良学，张明军，焦虎平，唐小春，任林柱，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22
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