检测异菌脲的酶联免疫试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种检测异菌脲的酶联免疫试剂盒，它包括：包被有包被原的酶标板、异菌脲标准品溶液、酶标二抗、异菌脲特异性抗体、底物显色液、终止液、洗涤液、复溶液，所述包被原为异菌脲偶联抗原，所述酶标二抗为酶标记的羊抗鼠抗抗体。本发明专利技术还公开了一种应用上述酶联免疫试剂盒检测异菌脲的方法。本发明专利技术提供的酶联免疫试剂盒可用于检测烟叶样本中异菌脲的含量，其操作简便、费用低廉、灵敏度高、能够现场监控且适合大量样本的筛查。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及酶联免疫检测技术，具体涉及一种用于检测异菌脲的酶联免疫试剂盒及其应用，可定性、定量检测烟叶中异菌脲的残留量。
技术介绍
异菌脲，又名扑海因，分子式为C13H13Cl2N3O3，属于二甲酰亚胺类，是一种广谱性触杀型保护性杀菌剂，广泛应用于烟草、果树、蔬菜的病害防治和水果的贮藏保鲜。异菌脲可以通过根部吸收起内吸作用，可有效防治对苯并咪唑类内吸杀菌剂有抗性的真菌。其主要防治对象为由葡萄孢菌、交链孢菌、核盘菌等引起的病害，如灰霉病、早疫病、黑斑病、菌核病等。异菌脲农药是日本、美国、韩国、澳大利亚、加拿大和食品法典委员会国有限量要求的检测项目，其在各类食品中最高残留限量为0.05~15mg/kg。目前，异菌脲的检测方法大多为液相色谱法和气相色谱法，所能检测的基质种类较少，对烟草中异菌脲的检测方法的相关专利和文献报道也较少。
技术实现思路
本专利技术的目的正是基于上述现有技术状况而提供一种能够检测烟草中异菌脲药物残留量的酶联免疫试剂盒，并提供一种高效、准确、简便、适于大批量样品筛选的定性、定量检测方法，应用本专利技术的酶联免疫法测定烟草中异菌脲的残留量，具有特异性好、操作简单、检测快速、检测成本低等优点。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：本专利技术试剂盒包括：包被有包被原的酶标板、异菌脲标准品溶液、酶标二抗、异菌脲特异性抗体、底物显色液、终止液、洗涤液、复溶液，所述包被原为异菌脲偶联抗原，所述包被原由异菌脲半抗原与载体蛋白偶联制备得到，所述酶标二抗为酶标记的羊抗鼠抗抗体，所述异菌脲半抗原是由2,6-二氯-4-硝基苯酚为起始原料，经过与4-溴丁酸叔丁酯的烃基化反应得到羟基2,6-二氯-4-硝基苯，还原硝基后，得到烃基2,6-二氯苯胺，烃基2,6-二氯苯胺在碳酰氯的作用下，与氨基乙酸缩合，得到烃基2,6-二氯苯甘氨酸酯，再经过成环反应，得到异菌脲主体结构化合物，该化合物再经碳酰氯作用，与异丙胺缩合，得到异菌脲母核结构化合物，在酸性条件下水解反应得到的。所述载体蛋白可为甲状腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白。所述异菌脲半抗原的分子结构如式Ⅰ：（式Ⅰ）。所述异菌脲特异性抗体是以异菌脲偶联抗原作为免疫原制备获得，所述异菌脲特异性抗体为异菌脲单克隆抗体。所述酶标记的标记酶为辣根过氧化物酶或细菌提取碱性磷酸酯酶，当标记酶为辣根过氧化物酶时，底物显色液A液为过氧化氢或过氧化脲，底物显色液B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺，终止液为2mol/L的硫酸或盐酸缓冲液；当标记酶为细菌提取碱性磷酸酯酶时，底物显色液为对硝基磷酸盐缓冲液，终止液为2mol/L硫酸。所述洗涤液pH值为7.4，含有0.5%~1.0%吐温-20、0.01‰~0.03‰叠氮化钠防腐剂、0.1~0.3mol/L的磷酸盐缓冲液；其中的百分比为重量体积百分比，单位g/mL。所述复溶液为pH值为7.0、0.02mol/L的磷酸盐缓冲液。所述异菌脲标准品溶液的浓度分别为0μg/L、0.5μg/L、1.5μg/L、4.5μg/L、13.5μg/L、40.5μg/L。其中在酶标板制备过程中所用到的包被缓冲液为pH值为9.6，0.05mol/L的碳酸盐缓冲液，封闭液为pH值为7.1~7.5，含有1%~3%(g/mL)酪蛋白、0.1~0.3mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比。本专利技术中酶标板的制备过程为：用包被缓冲液将包被原稀释成20μg/mL，每孔加入100μL，25℃避光孵育2h或4℃过夜，倾去孔中液体，用洗涤液洗涤2次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入150~200μL封闭液，25℃避光孵育1~2h，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存。本专利技术还提供了一种应用上述酶联免疫试剂盒检测异菌脲的方法，它包括步骤：（1）样品前处理；（2）用试剂盒进行检测；（3）分析检测结果。本专利技术检测异菌脲的酶联免疫试剂盒检测原理为：采用间接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被偶联抗原，样本中残留的异菌脲与微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗异菌脲的抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光值与其所含异菌脲的含量成负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可定性或定量检测出样品中异菌脲的残留量。本专利技术的试剂盒通过对2,6-二氯-4-硝基苯酚进行结构改造，合成了带有四个碳链长度的羧基半抗原，突出了异菌脲本身的分子结构，增强了免疫原性，使得制备得到的异菌脲单克隆抗体灵敏度高，特异性强，试剂盒对样品的前处理方法简单，无需用到有机溶剂，样品处理过程环保，能快速检测大批量样品；主要试剂以工作液的形式提供，检验方法方便易行，便于携带，试剂盒具有特异性高、灵敏度高、精确度高、准确度高、操作简单、检测时间短、检测成本低等特点适于大批量烟草样品的定性、定量筛查。附图说明图1为异菌脲半抗原合成路线图；图2为试剂盒标准曲线图。具体实施方式下面结合具体的实施例来进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术，而不用来限制本专利技术的范围。实施例1试剂盒组分的制备1、异菌脲半抗原的制备化合物a的合成：取5.0g2,6-二氯-4-硝基苯酚与3.2g4-溴丁酸叔丁酯在丙酮中搅拌，再向其中加入2.6g无水碳酸钾作为催化剂在60℃反应8h，反应停止后，蒸干溶剂，再加水与乙酸乙酯萃取，并用无水硫酸钠干燥，浓缩，过200-300目硅胶柱，层析分离纯化，得到化合物a5.23g，收率87%。1HNMR（CDCl3,300MHZ）δ:7.945(1H,d,J=0.000),4.144(2H,t,J=7.500),7.945(1H,d,J=0.000),1.973(2H,tt,J=7.500,J=7.367),2.359(2H,t,J=7.367),1.414(3H),1.414(3H),1.414(3H,s)。化合物b的合成：向20mL水中加入3.1g锌粉和1mL冰乙酸，在90℃反应30min，再加入5.2g化合物a的乙醇溶液80mL，在60℃反应4h，待反应停止，抽滤，蒸干，向其中加水与二氯甲烷萃取，静置，用无水硫酸钠干燥，用体积比为石油醚：乙酸乙酯=20:1重结晶，得到化合物b4.8g，收率91%。1HNMR（CDCl3,300MHZ）δ:6.898(1H,d,J=0.000),4.039(2H,t,J=7.500),6.898(1H,d,J=0.000),1.965(2H,tt,J=7.500,J=7.367),2.361(2H,t,J=7.367),1.414(3H),1.414(3H,s),1.414(3H,s)。化合物c的合成：取4.7g化合物b用100mL乙腈溶解，搅拌，向其中加入2.16g氨基乙酸，在氮气保护下，通入碳酰氯，在50℃下反应7h，停止反应后，再加入50mL氢氧化钠水溶液，震荡，旋蒸，除去乙腈，加乙酸乙酯溶解，加水洗涤，浓缩，蒸干，过200—300目硅胶柱，层析分离，得到化本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测异菌脲的酶联免疫试剂盒，其特征在于：包括包被有包被原的酶标板、异菌脲标准品溶液、酶标二抗、异菌脲特异性抗体、底物显色液、终止液、洗涤液、复溶液，所述包被原为异菌脲偶联抗原、所述包被原由异菌脲半抗原与载体蛋白偶联制备得到，所述酶标二抗为酶标记的羊抗鼠抗抗体，所述异菌脲半抗原是由2,6‑二氯‑4‑硝基苯酚为起始原料，经过与4‑溴丁酸叔丁酯的烃基化反应得到羟基2,6‑二氯‑4‑硝基苯，还原硝基后，得到烃基2,6‑二氯苯胺，烃基2,6‑二氯苯胺在碳酰氯的作用下，与氨基乙酸缩合，得到烃基2,6‑二氯苯甘氨酸酯，再经过成环反应，得到异菌脲主体结构化合物，该化合物再经碳酰氯作用，与异丙胺缩合，得到异菌脲母核结构化合物，在酸性条件下水解反应得到的。

【技术特征摘要】
1.一种检测异菌脲的酶联免疫试剂盒，其特征在于：包括包被有包被原的酶标板、异菌脲标准品溶液、酶标二抗、异菌脲特异性抗体、底物显色液、终止液、洗涤液、复溶液，所述包被原为异菌脲偶联抗原、所述包被原由异菌脲半抗原与载体蛋白偶联制备得到，所述酶标二抗为酶标记的羊抗鼠抗抗体，所述异菌脲半抗原是由2,6-二氯-4-硝基苯酚为起始原料，经过与4-溴丁酸叔丁酯的烃基化反应得到羟基2,6-二氯-4-硝基苯，还原硝基后，得到烃基2,6-二氯苯胺，烃基2,6-二氯苯胺在碳酰氯的作用下，与氨基乙酸缩合，得到烃基2,6-二氯苯甘氨酸酯，再经过成环反应，得到异菌脲主体结构化合物，该化合物再经碳酰氯作用，与异丙胺缩合，得到异菌脲母核结构化合物，在酸性条件下水解反应得到的。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述异菌脲偶联抗原是由异菌脲半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白为甲状腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白。
3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述异菌脲半抗原的分子结构如式Ⅰ：
（式Ⅰ）。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述异菌脲特异性抗体是以异菌脲偶联抗原作为免疫原制备获得，所述异菌脲特异...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈黎，范子彦，杨昌松，冯静，潘立宁，胡斌，唐纲岭，刘惠民，鲁亚辉，
申请(专利权)人：中国烟草总公司郑州烟草研究院，国家烟草质量监督检验中心，北京勤邦生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：河南;41