预扩增试验制造技术

本文提供了确定核酸预扩增反应效力的方法和组合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉参考本申请要求2014年5月2日提交的美国临时申请号61/987,921的优先权，在此引入以供所有目的的参考。
技术介绍
核酸分析常常需要在进一步下游分析前扩增一条序列或一组序列。这可能是由于被调查的序列在样品中是稀有的，或因为下游分析需要大量的起始材料。然而获自生物来源或环境的样品可能包含抑制扩增的因子。此外，样品之间也有差异.例如来自一个个体的血样可能比来自另一个个体的血样含有更多抑制因子，使得在第一种样品中预扩增步骤效果更差。这些问题可能会使下游分析更困难，或导致样品间的不一致结果。
技术实现思路
本文提供了能用于建立扩增反应效力的方法和成分。可在样品试验(assay)中加入这些成分，作为扩增反应的内部对照。本文提供了检测第一核酸扩增反应中的状况(例如由于异常或抑制剂造成扩增比预期少)的方法，该方法包括：配制第一混合物，其中第一混合物包含第一核酸模板(例如单链或双链核酸)、第二核酸模板、和对第一核酸模板特异性的第一组引物(例如能与第一核酸模板杂交)；对第一混合物进行第一循环数的第一扩增反应，产生产物(例如包含第一核酸模板的扩增产物)；配制第二混合物，其中第二混合物包含所述产物(例如所述产物的等份或稀释等份)、对第二核酸模板特异性的第二组引物、和对第一核酸模板的扩增产物特异性的第三组引物；对第二混合物进行第二扩增反应；确定第一核酸模板扩增达到Cq所需循环数(Cq1)和第二核酸模板扩增达到Cq所需循环数(Cq2)；和当达到Cq2所需的循环数和达到Cq1的循环数之间的差异(ΔCq)小于(例如小2％、5％、10％、20％、30％、40％、1-20％、或5-30％)循环数阈值(例如当第一核酸模板和第二核酸模板在第一混合物中以相同量存在时的第一循环数)时，在第一扩增反应中检测到状况。在一些实施方式中，第一核酸模板和第二核酸模板在分开的核酸分子上。在一些实施方式中，第一核酸模板和第二核酸模板是一条核酸分子上不重叠的模板。参见例如图1C。在一些实施方式中，第一核酸模板和第二核酸模板是一条核酸分子上重叠的模板。参见例如图1D。在一些实施方式中，第一混合物还包含样品(例如生物样品或其它怀疑含有感兴趣核酸的样品)。在一些实施方式中，第一混合物还包含对样品核酸模板(例如包含于怀疑的感兴趣核酸内的模板)特异性的第四组引物。在一些实施方式中，样品核酸模板包含遗传变体(例如CNV、SNP或突变)。在一些实施方式中，第二混合物还包含对样品核酸模板特异性的第五组引物。在一些实施方式中，第四和第五组引物是相同的。在一些实施方式中，第四和第五组引物是不同的(例如与样品核酸模板上的不同序列互补，或不同地标记)。在一些实施方式中，第一扩增反应是多重的，例如设计为扩增多个样品核酸模板。在一些实施方式中，第一混合物由此还包含对多条/种样品核酸模板特异性的多组引物。在一些实施方式中，所述第二扩增反应是多重的。在一些实施方式中，第二混合物还包含对获自第一扩增反应的样品核酸模板的扩增产物特异性的多组引物。在一些实施方式中，第一扩增产物分成多种“第二”混合物，每种设计用于检测来自第一扩增反应的样品核酸模板的一种或多种不同的扩增产物。在一些实施方式中，第一核酸模板和第二核酸模板在第一混合物中以等量存在。在一些实施方式中，第一核酸模板和第二核酸模板在同一条核酸分子(单链或双链)上。在一些实施方式中，第一和第二核酸模板长度相同，或长度差别在1-50个核苷酸内。在一些实施方式中，第一和第二核酸模板长50-2000个核苷酸，例如80-120或100-500个核苷酸，或长约100、200、250、300、500或750个核苷酸。在一些实施方式中，第一组引物与第三组引物相同。在一些实施方式中，第一和第三组引物是不同的(例如与第一核酸模板上的不同或重叠序列互补，或不同地标记)。在一些实施方式中，所述第一扩增反应是PCR。在一些实施方式中，第一循环数在1-25之间(例如4-10、5-15、2-8、6-20、10-24等)。在一些实施方式中，当达到Cq2所需循环数和达到Cq1所需循环数之间的差异比循环数阈值小约0.01-5个循环(例如0.1-1，小于1、0.01-2、3、4、5、2-5)时，检测到状况(例如异常或抑制)。在一些实施方式中，所述第一扩增反应是逆转录。在一些实施方式中，第一核酸模板是RNA，而第二核酸模板是DNA。在一些实施方式中，当达到Cq2所需循环数和达到Cq1所需循环数之间的差异是0.01-2(例如第一和第二核酸模板量相等(或尽可能接近))时，检测到状况(例如异常或抑制)。在一些实施方式中，第二扩增反应是PCR，例如qPCR(实时PCR或数字PCR)。在一些实施方式中，进行第二循环数的第二扩增反应。在一些实施方式中，第二循环数相当于或大于第一循环数。在一些实施方式中，在配制第二混合物前，至少部分从产物中除去第一组引物。在一些实施方式中，产物在第二混合物中稀释至少2倍(例如5倍、10倍、20倍、10-100倍)，例如作为等分的结果。还提供了在第一扩增反应中检测状况(例如比预期扩增少)的方法，该方法包括：配制第一混合物，其中第一混合物包含第一核酸模板、第二核酸模板、和对第一核酸模板特异性的第一组引物；对第一混合物进行第一循环数的第一扩增反应，产生产物；配制第二混合物，其中第二混合物含有所述产物、进行第二核酸试验的试剂；对第二混合物进行第二核酸试验；测定第二混合物中第一核酸模板量的指示信号和第二混合物中第二核酸模板量的指示信号；和当第二混合物中第一核酸量不显著高于第二核酸模板量(例如至少1.5倍、2倍、5倍、10倍、20倍等)时，检测到状况。在一些实施方式中，第二核酸试验是定量杂交试验。在一些实施方式中，进行第二核酸试验的试剂包括对第一核酸模板或其互补物特异性的带标记探针或引物。在一些实施方式中，进行第二核酸试验的试剂包括对第二核酸模板或其互补物特异性的带标记探针或引物。在一些实施方式中，进行第二核酸试验的试剂包括对第一和第二核酸模板特异性的带标记探针和/或引物。在一些实施方式中，第一混合物还包含样品(例如生物样品或其它怀疑含有感兴趣核酸的样品)。在一些实施方式中，第一混合物还包含对样品核酸模板(例如包含于怀疑的感兴趣核酸内的模板)特异性的一组引物。在一些实施方式中，样品核酸模板包含遗传变体(例如CNV、SNP本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测第一扩增反应中的状况的方法，其特征在于，包括：配制第一混合物，其中所述第一混合物包含第一核酸模板、第二核酸模板、对第一核酸模板特异性的第一组引物、和包含样品核酸的样品；对所述第一混合物进行第一循环数的第一扩增反应，产生产物；配制第二混合物，其中所述第二混合物包含产物、对第二核酸模板特异性的第二组引物、和对第一核酸模板的扩增产物特异性的第三组引物；对所述第二混合物进行第二扩增反应，其中所述第二扩增反应是定量的；确定和比较第一核酸模板扩增达到Cq所需循环数(Cq1)和第二模板扩增达到Cq所需循环数(Cq2)；和当达到Cq2所需的循环数和达到Cq1的循环数之间的差异小于循环数阈值时，在所述第一扩增反应中检测到状况。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.05.02 US 61/987,9211.一种检测第一扩增反应中的状况的方法，其特征在于，包括：
配制第一混合物，其中所述第一混合物包含第一核酸模板、第二核酸模板、
对第一核酸模板特异性的第一组引物、和包含样品核酸的样品；
对所述第一混合物进行第一循环数的第一扩增反应，产生产物；
配制第二混合物，其中所述第二混合物包含产物、对第二核酸模板特异性的
第二组引物、和对第一核酸模板的扩增产物特异性的第三组引物；
对所述第二混合物进行第二扩增反应，其中所述第二扩增反应是定量的；
确定和比较第一核酸模板扩增达到Cq所需循环数(Cq1)和第二模板扩增达到
Cq所需循环数(Cq2)；和
当达到Cq2所需的循环数和达到Cq1的循环数之间的差异小于循环数阈值时，
在所述第一扩增反应中检测到状况。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述循环数阈值与第一循环数相
差1个循环以内。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第一混合物还包含对样品核
酸模板特异性的第四组引物。
4.如前任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述第一核酸模板和第二核
酸模板在所述第一混合物中等量存在。
5.如前任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述第一核酸模板和第二核
酸模板是一条核酸分子上不重叠的模板。
6.如前任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述第一核酸模板和第二核
酸模板是一条核酸分子上重叠的模板。
7.如前任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述第一组引物和所述第三
组引物相同。
8.如前任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述第一扩增反应是PCR。
9.如前任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述第一循环数是10-20。
10.如权利要求1-7任一所述的方法，其特征在于，所述第一扩增反应是逆
转录，所述第一核酸模板是RNA。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述第二核酸模板是DNA。
12.如前任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述第一核酸模板和第二
核酸模板长度相同或相差在10个核苷酸内。
13.如前任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述第二扩增反应是实时
PCR或数字PCR。
14.如前任一权利要求所述的方法，其特征在于，在配制所述第二混合物前
从所述产物除去所述第一组引物。
15.如前任一权利要求所述的方法，其特征在于，在所述第二混合物中所述
产物至少稀释10倍。
16.一种试剂盒，所述试剂盒包含：
装有对第一核酸模板特异性的第一组引物的第一容器；
装有对第二核酸模板特异性的第二组引物的第二容器；
第一核酸模板和第二核酸模板；和
对第一核酸模板的扩增产物特异性的第三组引物。
17.如权利要求16所述的试剂...

【专利技术属性】
技术研发人员：Y·孔，S·冲野，
申请(专利权)人：生物辐射实验室股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US