一种高纯度牦牛血清白蛋白的生产工艺制造技术

本发明专利技术公开了一种高纯度牦牛血清白蛋白的生产工艺，由以下步骤组成：在牦牛血中加入柠檬酸钠和氯化钠，分离血浆与红细胞，血浆经离心、过滤提取后，放入夹层反应罐内，加热并加入辛酸钠、氯化钠、乙醇或甲醇，缓慢搅拌，分两次加入盐酸调pH值，离心，上清液加沉淀试剂磨成糊状，搅拌，冷藏过夜后离心分离沉淀，沉淀加水溶解，以氢氧化钠溶液调pH后静置，离心分离上清液，过滤和病毒灭活，冻干为成品。本发明专利技术制备工艺简单，用料少、工艺流程短，工艺流程操作容易、产品收率高、成本低、产品质量好；生产易实现规模化、自动化控制；使产品具有更高的可靠性与安全性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体是一种高纯度牦牛血清白蛋白的生产工艺。
技术介绍
牛血清白蛋白(BovineSerumAlbumin,BSA)是牛血清中的一种球蛋白，包含583个氨基酸残基，分子量为66.43kDa，等电点为4.7，含氮量为16％，含糖量为0.08％，含脂量只有0.2％；白蛋白可与多种阳离子、阴离子和其他小分子物质结合，BSA是生物学诸多学科及医、药学各领域广泛应用的生化试剂，例如在westernblot中作为封闭试剂，血液中的白蛋白主要起维持渗透压作用、pH缓冲作用、载体作用和营养作用；在动物细胞无血清培养中，添加白蛋白可起到生理和机械保护作用和载体作用。BSA的制备方法较多，但多数尚处于实验阶段，目前市场上的BSA主要采用以下两种方法制得：(1)盐析法，用硫酸铵分级沉淀后，经辛酸处理精制而得；(2)有机溶剂沉淀法，以E.J.Cohn氏法最常用，最早用于人血液制品的生产，利用乙醇的低介电常数性质以及蛋白质在一定温度、pH、离子强度及浓度条件下在不同浓度乙醇中溶解度不同分离血浆蛋白质,可以生产出多种血浆蛋白。盐析法为最传统的生产方法，此法原理较为简单，但是硫酸铵对设备有一定的腐蚀性，整个工艺比较耗时，且硫酸铵用量很多，所得产品纯度只有80％～90％，收率一般为0.8～1.0％，以上导致此法生产效率低，成本偏高；利用冷乙醇沉淀法也有一些不足：乙醇是一种非特异性沉淀剂，尽管BSA生产效率显著，但产品纯度不是很高，作为有机溶剂的乙醇还可能使蛋白质发生聚集或变性，为了避免蛋白质变性，必须在－20℃的低温环境中进行，设备与厂房的投入很大，乙醇易燃，给生产带来安全隐患，单程需7日，能源消耗巨大，费时费力，生产不易实现自动化，有机溶剂沉淀法所得BSA纯度在90％～95％，收率在10％左右，相对而言成本比较高，从而使其产品因在市场中售价偏高而降低了竞争力。青藏高原牦牛生活在海拔3000米以上的高原地区，为了适应高海拔地区的缺氧环境，其血液中红细胞数量相比普通牛血红细胞高很多，简单套用传统牛血清白蛋白生产方法会使产品中杂蛋白含量较高，传统牛血清白蛋白生产方法对牦牛血白蛋白不适用。因此，一种针对高原牦牛血白蛋白的生产方法对开发青藏高原特有牦牛血白蛋白的意义很大。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种适合于大规模生产的高纯度牦牛血清白蛋白的生产工艺，此方法不仅工艺相对简单，而且用料少，收率高，产品纯度高；可较大幅度的降低成本。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种高纯度牦牛血清白蛋白的生产工艺，由以下步骤组成：1)、取新鲜牦牛血，再加入柠檬酸钠、氯化钠，其中柠檬酸钠与牦牛血的质量体积比为0.43％(w/v)，氯化钠与牦牛血的质量体积比为0.09％(w/v)，然后牦牛血于0～10℃冷库中静置，待血浆与红细胞分层后，用虹吸法吸取血浆，下层血球另用；2)、取上述分离血浆，置于具有制冷装置的离心系统中，设定离心系统的温度为2℃～8℃，开启离心机离心，收集血浆，血浆再用0.22μm的微孔滤膜过滤，得精制血浆；3)、将精制血浆放入夹层反应罐内，夹层罐加热至65℃～80℃；取辛酸钠、氯化钠加入到与精制血浆等体积的纯化水中溶解，溶解后的溶液加入到精制血浆中，得到的混合溶液，其中辛酸钠与混合溶液的质量体积比为0.28～0.43％(w/v)，氯化钠与混合溶液的质量体积比为0.9％(w/v)；再加入乙醇或甲醇溶液，使乙醇或甲醇的体积浓度达到5.0％～10.0％(V/V)，搅拌均匀，加入盐酸调pH值为5.5～6.5，并在温度为65℃～80℃下保温20min～60min后，将溶液加入到搅拌罐中，使溶液降温到室温，再次用盐酸调pH值为3.8～4.5，密封放置；4)、取上述溶液，置于离心系统中离心，收集上清液，加入沉淀试剂，使其体积浓度为20％～25％，用胶体磨边加上清液边加沉淀试剂打磨成糊状，搅拌后于2～8℃冷库保存过夜；5)、取上述混合溶液，置于离心系统中，设定离心系统的温度为2℃～10℃，离心分离取沉淀物，-20℃冷库中保存备用；6)、根据血浆量称取注射用水，加入到上述沉淀物中，搅拌至完全溶解，用氢氧化钠溶液调节pH值为6.0～7.5，室温放置；置于离心系统中，设定离心系统的温度为8℃～10℃，离心收集上清液；上清液用洁净的0.22μm的微孔滤膜过滤，滤液备用；7)、病毒灭活：设定水浴的温度为60℃，将过滤后的滤液放至水浴中，待滤液的温度达到60℃，保温放置10小时，进行病毒灭活，然后用0.22μm的微孔滤膜过滤，制得病毒灭活滤液，取样检测蛋白质含量；8)、冻干，将病毒灭活滤液按冻干曲线冻干，得到成品，冻干曲线为：将病毒灭活滤液迅速冷却至-45℃，持续1～2小时，升到-20℃，持续10～20小时，再缓慢升温到0℃，再持续4～8小时升到室温25℃。作为本专利技术进一步的方案：所述步骤2)的离心机离心的转速为3000转/分钟～5000转/分钟，离心时间为30min～60min。作为本专利技术进一步的方案：所述步骤4)中离心系统离心的转速为3000转/分钟～5000转/分钟，离心时间为30min～60min。作为本专利技术进一步的方案：所述步骤5)中离心系统离心的转速为5000转/分钟～10000转/分钟，离心时间为30min～60min。作为本专利技术进一步的方案：所述步骤6)中离心系统离心的转速为5000转/分钟～10000转/分钟，离心时间为30min～60min。作为本专利技术进一步的方案：沉淀试剂采用聚乙二醇6000、聚乙二醇4000或聚乙二醇5000。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：1.本专利技术是一种高纯度牦牛血白蛋白的生产，制备工艺简单，生产易实现规模化、自动化控制；2.本专利技术利用牦牛血作为原料进行牦牛血清白蛋白提纯。由于牦牛携带人类的传染性疾病传播风险极小，避免了人类血源性疾病的传播机会；3.本专利技术在制备工艺中包括了病毒灭活等工艺方法，使产品具有更高的可靠性与安全性；4.本专利技术与传统工艺相比其用料少、工艺流程短，工艺流程操作容易、产品收率高、成本低、产品质量好；5.本专利技术生产安全环保。制备工艺的操作过程中对人员和周围环境不产生危害，符合国家的环保要求。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高纯度牦牛血清白蛋白的生产工艺，其特征在于，由以下步骤组成：1)、取新鲜牦牛血，再加入柠檬酸钠、氯化钠，其中柠檬酸钠与牦牛血的质量体积比为0.43％(w/v)，氯化钠与牦牛血的质量体积比为0.09％(w/v)，然后牦牛血于0～10℃冷库中静置，待血浆与红细胞分层后，用虹吸法吸取血浆，下层血球另用；2)、取上述分离血浆，置于具有制冷装置的离心系统中，设定离心系统的温度为2℃～8℃，开启离心机离心，收集血浆，血浆再用0.22μm的微孔滤膜过滤，得精制血浆；3)、将精制血浆放入夹层反应罐内，夹层罐加热至65℃～80℃；取辛酸钠、氯化钠加入到与精制血浆等体积的纯化水中溶解，溶解后的溶液加入到精制血浆中，得到的混合溶液，其中辛酸钠与混合溶液的质量体积比为0.28～0.43％(w/v)，氯化钠与混合溶液的质量体积比为0.9％(w/v)；再加入乙醇或甲醇溶液，使乙醇或甲醇的体积浓度达到5.0％～10.0％(V/V)，搅拌均匀，加入盐酸调pH值为5.5～6.5，并在温度为65℃～80℃下保温20min～60min后，将溶液加入到搅拌罐中，使溶液降温到室温，再次用盐酸调pH值为3.8～4.5，密封放置；4)、取上述溶液，置于离心系统中离心，收集上清液，加入沉淀试剂，使其体积浓度为20％～25％，用胶体磨边加上清液边加沉淀试剂打磨成糊状，搅拌后于2～8℃冷库保存过夜；5)、取上述混合溶液，置于离心系统中，设定离心系统的温度为2℃～10℃，离心分离取沉淀物，‑20℃冷库中保存备用；6)、根据血浆量称取注射用水，加入到上述沉淀物中，搅拌至完全溶解，用氢氧化钠溶液调节pH值为6.0～7.5，室温放置；置于离心系统中，设定离心系统的温度为8℃～10℃，离心收集上清液；上清液用洁净的0.22μm的微孔滤膜过滤，滤液备用；7)、病毒灭活：设定水浴的温度为60℃，将过滤后的滤液放至水浴中，待滤液的温度达到60℃，保温放置10小时，进行病毒灭活，然后用0.22μm的微孔滤膜过滤，制得病毒灭活滤液，取样检测蛋白质含量；8)、冻干，将病毒灭活滤液按冻干曲线冻干，得到成品，冻干曲线为：将病毒灭活滤液迅速冷却至‑45℃，持续1～2小时，升到‑20℃，持续10～20小时，再缓慢升温到0℃，再持续4～8小时升到室温25℃。...

【技术特征摘要】
1.一种高纯度牦牛血清白蛋白的生产工艺，其特征在于，由以下步骤组成：
1)、取新鲜牦牛血，再加入柠檬酸钠、氯化钠，其中柠檬酸钠与牦牛血的质量体积
比为0.43％(w/v)，氯化钠与牦牛血的质量体积比为0.09％(w/v)，然后牦牛血于0～
10℃冷库中静置，待血浆与红细胞分层后，用虹吸法吸取血浆，下层血球另用；
2)、取上述分离血浆，置于具有制冷装置的离心系统中，设定离心系统的温度为2℃～
8℃，开启离心机离心，收集血浆，血浆再用0.22μm的微孔滤膜过滤，得精制血浆；
3)、将精制血浆放入夹层反应罐内，夹层罐加热至65℃～80℃；取辛酸钠、氯化钠
加入到与精制血浆等体积的纯化水中溶解，溶解后的溶液加入到精制血浆中，得到的混合
溶液，其中辛酸钠与混合溶液的质量体积比为0.28～0.43％(w/v)，氯化钠与混合溶液
的质量体积比为0.9％(w/v)；再加入乙醇或甲醇溶液，使乙醇或甲醇的体积浓度达到
5.0％～10.0％(V/V)，搅拌均匀，加入盐酸调pH值为5.5～6.5，并在温度为65℃～80℃
下保温20min～60min后，将溶液加入到搅拌罐中，使溶液降温到室温，再次用盐酸调pH
值为3.8～4.5，密封放置；
4)、取上述溶液，置于离心系统中离心，收集上清液，加入沉淀试剂，使其体积浓
度为20％～25％，用胶体磨边加上清液边加沉淀试剂打磨成糊状，搅拌后于2～8℃冷库
保存过夜；
5)、取上述混合溶液，置于离心系统中，设定离心系统的温度为2℃～10℃，离心分
离取沉淀物，-20℃冷库中保存备用；
6)、根据血浆量称取注射用水，加入到上述沉淀物中，搅拌至完全溶解，用氢氧化
钠溶液调节p...

【专利技术属性】
技术研发人员：许卫红，
申请(专利权)人：青海北极牦牛生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：青海;63