本发明专利技术涉及一种伪狂犬病病毒双荧光标记5基因缺失株的构建。该病毒株是以自行分离的一株伪狂犬病病毒(SX株)为母本，通过分子生物学手段，缺失伪狂犬病病毒的gE基因、gI基因、US9基因、UL49.5部分基因和TK基因，并以绿色荧光蛋白(GFP)和红色荧光蛋白(RFP)作为标记蛋白代替缺失的基因，获得双荧光标记的5基因缺失病毒株(rPRV/gE-/gI-/US9-/△UL49.5/TK-/GFP+/RFP+)。本发明专利技术建立了一套伪狂犬活病毒载体系统；双荧光蛋白标记便于今后基因工程操作的筛选和鉴定；可同时插入多种外源基因，较一般活载体系统更加高效。该双荧光标记缺失病毒作为活载体的成功构建，为研制重组伪狂犬病基因工程疫苗奠定了基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一株双荧光标记5基因（gE、gl、US9、UL49. 5、TK)缺失伪狂犬病病毒 的构建，属于生物技术和动物病毒学领域。
技术介绍
伪狂犬病（Pseudorabies，PR ;又名 Aujeszky' s disease，AD)是由伪狂犬病病毒 (Pseudorabies virus，PRV)引起的一种急性传染病，可感染多种家畜、伴侣动物及野生动 物。猪是感染后可以存活的唯一物种，也是病毒贮存宿主。感染猪主要表现为神经症状、流 涎、呼吸困难、母猪繁殖障碍、仔猪高死亡率等，给养猪业造成巨大的经济损失。 PRV是疱疹病毒科、α疱疹病毒亚科、水痘病毒属的成员。PRV基因组为线性双股 DNA，约145Kb，由长独特区（UL)和短独特区（US)及US两侧的末端倒转重复（TR)与内部 重复（IR)组成，可编码70-100种蛋白质，成熟的病毒粒子约有50种蛋白。在上述基因产 物中，UL区段中的gC、TK及US区段中的PK、gG、gl、gE、llK和28K为病毒增殖的非必需成 份，一般认为，TK、gC、gE、PK和CP (衣壳蛋白）等与PRV毒力相关。另外，疱疹病毒基因组 中，UL49. 5编码的囊膜蛋白gN能抑制TAP介导的多肽转运到内质网，在病毒感染的细胞内 阻断MHC I类复合体的装配，从而下调MHC I类分子在细胞表面的表达，使得病毒有可能逃 避宿主CDS+T细胞的识别，并在宿主鼻腔及上呼吸道上皮细胞中复制，引起化脓性反应或组 织溃烂，进而导致细菌二次感染及严重的肺炎。 疫苗免疫接种是防制伪狂犬病的主要策略。伪狂犬疫苗主要分为三种：一是常 规疫苗，即灭活疫苗和弱毒活疫苗，如目前应用较多的Bartha-Kei株活疫苗；二是基因缺 失疫苗，即通过分子生物学方法，人工缺失某些基因，使其毒力减弱的同时又保留其免疫原 性。目前构建的伪狂犬病病毒基因工程疫苗大多为TK、gl、gE、gG基因的单基因缺失或多 基因缺失突变株。 PRV作为基因工程载体具备相当的优势：（I)PRV不感染人，具有很好的安全性。现 有的活疫苗株Bartha-K61或'783'等在世界上已应用了几十年，未发生重大的安全事故。 (2)基因组容量大：在PRV长达145Kb的基因组中，约一半基因被认为是非必需的，如gl、 gE、gM、TK、PK、gC和dUTPase等，在这些区域可先后或同时插入和表达多种外源基因而不 显著影响其繁殖及免疫原性。（3)生产原材料来源方便，生产成本低：PRV疫苗可以接种SPF 鸡胚成纤维细胞及PK15、ST等传代细胞生产，原材料充足，生产工艺成熟，且PRV病毒滴度 很容易达到免疫要求，大大降低了生产成本。（4)免疫期长：PRV以细胞免疫为主，病毒可以 较长时间感染，外源基因可以在体内持续表达。（5)宿主范围广，多种家畜、经济动物（如狐 和貂）、伴侣动物及野生动物均可感染PRV，可研制针对不同动物的活载体疫苗。
技术实现思路
本专利技术的目的是将自行分离并经鉴定命名为伪狂犬病病毒SX株作为亲本毒，经 基因工程方法构建缺失gE、gl、US9、部分UL49. 5基因和TK基因并插入GFP和RFP标记的 重组病毒；并以该重组病毒作为疫苗候选毒株或伪狂犬活病毒载体系统，用于基因工程疫 苗的开发和应用。 本专利技术的技术方案 1. -种伪狂犬病病毒株，其特征在于所述该病毒株为伪狂犬病毒（Pseudorabies virus)rPRV/gE _ /gl _ /US9 _ / Λ UL49. 5/TK _ /GFP+/RFP+株已于 2015 年 11 月 11 日送交 北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No. 11493。 2. 一种伪狂犬病病毒株，其特征在于该伪狂犬病病毒株同时缺失了 gE基因、gl基 因、US9基因、TK基因和部分UL49. 5基因五种伪狂犬病病毒基因，在基因缺失的部位通过同 源重组分别插入绿色荧光蛋白（GFP)基因和红色荧光蛋白（RFP)基因作为标记物。 3.如权利要求1所述伪狂犬病病毒株，其特征在于缺失的UL49. 5部分基因包括其 所表达的gN蛋白的胞外域37~40氨基酸所对应的12个核苷酸序列及胞质尾区（CT)全 部51个核苷酸序列。 4.如权利要求1所述的伪狂犬病病毒株的构建方法，其特征在于该毒株构建的步 骤为： (1)亲本毒株：用自主分离和鉴定并命名为伪狂犬病病毒（PRV)SX株作为亲本毒 株； (2)转移载体的构建：以pMD-18T克隆载体为骨架载体，构建四种转移载体： 第一种转移载体为PMD-US6-GFP-US2,插入伪狂犬病病毒gl、gE和US9两端的US6 和US2部分基因序列作为同源臂，左右同源臂间插入GFP基因；第二种转移载体为 PMD-UL50-UL49. 5- Λ 37~40-CT-RFP-UL49,插入UL49. 5基因 CT序列两端部分基因序列 作为同源臂，左右同源臂间插入RFP基因；第三种转移载体为PMD-UL50-UL49. 5- Λ 37~ 40-CT-UL49,插入UL49. 5基因 CT基因两端部分基因序列作为同源臂，将第二种转移载体 引入的RFP基因敲除；第四种转移载体为pMD-UL24-RFP-UL22,插入伪狂犬病病毒TK基因 两端的UL24和UL22部分基因序列作为同源臂，左右同源臂间插入RFP基因； (3)双荧光标记缺失病毒的构建：首先将（2)中的pMD-US6-GFP-US2转移载体 与亲本株PRVSX株共转染ΡΚ15细胞，通过克隆筛选，获得含GFP标记蛋白的缺失病毒株 (rPRV/gE /gl /US9 /GFP+株）；第二步将上一步缺失株与 pMD-UL49. 5- Λ 37-40-CT-RFP 转 移载体共感染ΡΚ15细胞，筛选出缺失株（rPRV/gE /gl /US9 / Λ UL49. 5/GFP+/RFP+株）后， 再通过同源重组将RFP标记基因敲除；第三步将筛选的rPRV/gE /gl /US9 / Λ UL49. 5缺失 株再与PMD-UL24-RFP-UL22转移载体共转染ΡΚ15细胞，通过克隆筛选获得双荧光标记缺失 病毒 rPRV/gE /gl /US9 / Λ UL49. 5/TK /GFP+/RFP+株。 5.权利要求1所述的伪狂犬病病毒株的应用，其特征在于rPRV/gE/gl / US9 / Λ UL49. 5/TK /GFP+/RFP+株作为候选毒株，敲除其中GFP和RFP后作为疫苗生产毒株 用于制备伪狂犬病活疫苗。 6.权利要求1所述的伪狂犬病病毒株的应用，其特征在于rPRV/gE/gl / US9 / Λ UL49. 5/TK /GFP+/RFP+株作为活载体病毒插入一种和/或多种动物病原抗原基因， 以获得表达外源基因的重组病毒，制备基因工程活载体疫苗，达到同时防制多种疾病的目 的。 本专利技术技术路线如下： 1.通过基因克隆技术以PRV(SX株）部分US6和US2基因序列作为同源臂，以及 绿色荧光蛋白基因 GFP作为筛选标记构建转移载体pMD-US6-GFP-US2,将PRV(SX株）病毒 和转移载体共转染PK15本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种伪狂犬病病毒株，其特征在于所述该病毒株为伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)rPRV/gE‑/gI‑/US9‑/△UL49.5/TK‑/GFP+/RFP+株已于2015年11月11日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.11493。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李俊平，杨承槐，陈晓春，李慧姣，孙莹，张广川，李启红，曹明慧，李岭，
申请(专利权)人：中国兽医药品监察所，
类型：发明
国别省市：北京;11
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