一种NKT细胞的培养方法和用途技术

本发明专利技术涉及一种NKT细胞的培养方法和用途。所述NKT细胞的培养方法，包括将巨噬细胞与NKT细胞共培养的步骤。巨噬细胞具有增强NKT细胞杀伤活性的用途。本发明专利技术将单核细胞从单个核细胞中分选出来，然后采用一定浓度的GM-CSF对单核细胞进行诱导，使之成为巨噬细胞。悬浮细胞培养成NKT细胞，之后将巨噬细胞和NKT细胞二者共培养。巨噬细胞可以直接吞噬细胞，同时也具有一定的抗原提呈功能，故二者共培养，直接提高了NKT细胞的杀伤活性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及细胞培养领域，尤其涉及一种NKT细胞的培养方法和用途。
技术介绍
自体免疫细胞疗法是肿瘤生物治疗的重要方法之一。自体免疫细胞疗法是将从自 体外周血中分离出单个核细胞，在多种免疫活性因子的作用下，通过体外培养，有效活化和 扩增为免疫活性细胞，包括NK细胞、CIK细胞和NKT (naturalkiIlerT)细胞等，再输入患者 体内，使免疫细胞直接杀伤肿瘤细胞或病毒感染细胞，或调节和增强机体的免疫功能的治 疗方法 NKT细胞是人外周血单个核细胞在体外经IL-2等多种细胞因子刺激后，获得的以 表达CD3+CD6 +标志为主的免疫效应细胞，具有T淋巴细胞的杀瘤活性，为新一代杀伤效应细 胞。NKT细胞的主要特征为T细胞受体（TCR)基因表达的恒定性、CDld的限制性以及细胞 因子产生的迅速、高水平性。NKT细胞既能增强免疫反应又能抑制免疫反应，从而在抗肿瘤、 抗感染、抑制自身免疫性疾病及移植耐受中发挥重要作用。NKT细胞虽也以⑶3 +⑶6+标志 的细胞为效应细胞，但是和CIK细胞的不同，NKT来源于外周血中CD4 CD8标志的细胞。 目前NKT细胞的制备方法一般是直接分离外周血中的单个核细胞（PBMC)，然后将 PBMC在含有一定浓度的IL-2、IL-15的培养基中培养2周得到NKT细胞。但现有技术中培 养得到的NKT细胞杀伤活性较低。
技术实现思路
有鉴于此，有必要针对现有技术中NKT细胞杀伤活性低的问题，提供一种NKT细胞 的培养方法和用途。 为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案： -种NKT细胞的培养方法，包括将巨噬细胞与NKT细胞共培养的步骤。 优选地，所述NKT细胞的培养方法，包括以下步骤： Sl、细胞的分选： 自PBMC中分选出单核细胞； S2、巨噬细胞的诱导： 将步骤Sl分选得到的单核细胞诱导为巨噬细胞； S3、NKT细胞的诱导： 将步骤Sl分选剩余的细胞诱导为NKT细胞； S4、巨噬细胞和NKT细胞共培养： 将S2获得的巨噬细胞和S3获得的NKT细胞共培养7-8天。 优选地，所述步骤S2中使用肿瘤细胞裂解液上清刺激巨噬细胞。 优选地，所述步骤S2中巨噬细胞的诱导具体方法为：用巨噬细胞诱导培养基培养 单核细胞，培养至第4天加入肿瘤细胞裂解液上清，培养至第6天收集巨噬细胞；所述巨噬 细胞诱导培养基的组成为：500-1000U/mL GM-CSF(粒细胞和巨噬细胞集落刺激因子）、体 积分数3-10%自体血浆、余量为X-VIVO 15无血清培养基。 优选地，所述肿瘤细胞裂解液上清中蛋白终浓度为1-10 μ g/mL，优选5 μ g/mL。肿 瘤细胞裂解液上清可以促进巨噬细胞的增殖和成熟，增强巨噬细胞对肿瘤细胞的识别作用 和杀伤活性。所述肿瘤细胞裂解液通过反复冻融方法制备。 优选地，所述步骤S3中NKT细胞的诱导具体方法为：用NKT细胞用培养基培养步 骤Sl分选后剩余的细胞，培养至第6天收集NKT细胞；所述NKT细胞用培养基的组成为： 100-500U/mL IL-2 (白细胞介素-2)、10-100 μ g/mL IL-15 (白细胞介素-15)、10-100 μ g/ mL IL-21(白细胞介素-21)、余量为X-VIVO 15无血清培养基。 优选地，所述步骤S4中巨噬细胞和NKT细胞共培养具体方法为：将S2获得的巨噬 细胞和S3获得的NKT细胞用NKT细胞用培养基共同培养7-8天。 优选地，步骤S2-S4中的培养条件为37°C、5% C02。 优选地，所述步骤S2-S4在培养过程中按照I X 106cells/mL的细胞密度补加培养 液和细胞因子。 优选地，巨噬细胞与NKT细胞按数量比1:10-25共培养。 更优选地，巨噬细胞与NKT细胞按数量比1:15-20共培养。 更进一步优选地，巨噬细胞与NKT细胞按数量比1:20共培养。 本专利技术还提供巨噬细胞的用途，巨噬细胞用于增强NKT细胞杀伤活性的用途。 与现有技术相比，本专利技术提供的巨噬细胞培养方法有以下优点： 本专利技术将单核细胞从单个核细胞中分选出来，然后采用一定浓度的GM-CSF对单 核细胞进行诱导，使之成为巨噬细胞。PBMC分选出单核细胞后的剩余细胞为悬浮细胞，将悬 浮细胞培养成NKT细胞，之后将巨噬细胞和NKT细胞二者共培养。巨噬细胞可以直接吞噬 细胞，同时也具有一定的抗原提呈功能，故将巨噬细胞与NKT细胞共培养，直接提高了 NKT 细胞的杀伤活性。 本专利技术采用特异性的肿瘤细胞裂解液上清对巨噬细胞进行刺激，得到的巨噬细胞 抗原提呈能力更强。如NKT细胞对K562细胞进行杀伤时，在培养巨噬细胞的时候，采用K562 细胞裂解液上清对巨噬细胞进行刺激。NKT细胞对HL60细胞进行杀伤时，在培养巨噬细胞 的时候，采用HL60细胞裂解液上清对巨噬细胞进行刺激。【附图说明】 图1为本专利技术NKT细胞的培养方法的流程图。 图2为本专利技术实施例1中细胞形态图。其中，图2A和图2B分别为NKT细胞诱导 第1天、第6天的形态，图2C和图2D分别为NKT细胞与巨噬细胞共培养第1天、第7天的 形态。 图3为本专利技术实施例1中获得的巨噬细胞的流式检测结果图。 图4为本专利技术效果实施例1中流式检测结果图。其中图4A和图4B为采用实施例 1方法获得的NKT细胞，图4C和图4D为采用对比例1方法获得的NKT细胞。 图5为效果实施例3中增殖曲线图。【具体实施方式】 为了更好的说明本专利技术，下面结合附图和具体实施例做进一步说明。本专利技术中 K562细胞（人白血病细胞）、HL60细胞（人原髓细胞白血病细胞）和H印G2细胞（人肝癌 细胞）由暨南大学生物医药研究基地惠赠，所用试剂或仪器均可由市场购得，使用的检测 方法等都是本领域所熟知的，在此不再赘述。 实施例1、NKT细胞的培养方法 -种NKT细胞的培养方法，包括以下步骤： Sl、细胞的分选：用⑶14分选试剂盒（购自STEM CELL公司）自PBMC悬液中分选 出单核细胞（CD14+细胞），剩余细胞为悬浮细胞（CD14细胞）。 S2、巨噬细胞的诱导：用巨噬细胞诱导培养基重悬单核细胞，按照 I X 106-2X IO6ceIlsAiL的密度接种至细胞培养瓶中，用巨噬细胞诱导培养基于37°C、5 % CO2条件下培养，定期进行观察，每隔2-3天按照I X 10 6CellsAiL的细胞密度补加培养液和 细胞因子。培养第4天加入蛋白终浓度5 μ g/mL的K562细胞裂解液上清进行刺激，第5天 收集部分细胞进行流式鉴定，第6天收集巨噬细胞。所述巨噬细胞诱导培养基的组成为： 500U/mL GM-CSF、体积分数5%自体血浆，余量为X-VIVO 15无血清培养基。 S3、NKT细胞的诱导：用NKT细胞用培养基重悬悬浮细胞，按照 I X 106-2X Kfcells/mL的密度接种至细胞培养瓶中，用NKT细胞用培养基在37°C、5% CO2 条件下培养。定期在倒置显微镜下观察细胞的状态，每隔1-2天按照I X Kfcells/mL的细 胞密度补加培养液和细胞因子。第6天收集NKT细胞。所述NKT细胞用培养基的组成为： lOOU/mL IL-2、50yg/mL IL-15、100yg/mL IL-21，余量为 X-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种NKT细胞的培养方法，其特征在于：将巨噬细胞与NKT细胞共培养。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王一飞，陈海佳，葛啸虎，罗二梅，张维敏，
申请(专利权)人：广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44