本发明专利技术公开了一种茶树NRT1基因，其序列如SEQ ID No.1所示。本发明专利技术还公开了一种茶树NRT1蛋白，其序列如SEQ ID No.2所示。本发明专利技术还公开了上述茶树NRT1基因表达方法。茶树NRT1基因序列全长为1880bp，编码594个氨基酸，其蛋白质分子量为65.92kD，理论等电点为9.07043。含有12个跨膜螺旋区，其中，第6个和第7个跨膜结构域之间存在一个大的亲水环。且该蛋白为亲水性蛋白，茶树NRT1为组成型基因。说明茶树不同组织部位中，吸收同化NO3-的机理可能存在差异，也说明NRT1不仅只作为硝酸盐转运蛋白，其更可能是感受硝酸盐的信号受体。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种茶树NRTl基因、蛋白及基因表达方法，属于分子生物学领域。
技术介绍
茶树是原产中国的多年生木本植物，它以叶片为收获 目标，对氮素需求量较大。氮肥施用量与茶叶品质成分氨基酸、茶多酚含量密切相关，所以， 氮肥是茶园中主要的肥料，通常占施肥总量的一半以上（Kamau et al.，2008)。茶树对不同 氮源具有偏性吸收特性，吸收铵态氮的量高于吸收的硝态氮十倍以上，研究表明，造成这种 差异的原因，主要在于吸收运载系统的差异（杜旭华和彭方仁，2010 ;Yang et al.，2013)。 故研究茶树NO3吸收、转运和累积的机制，对于提高其NO 3的利用效率，从而提高茶树氮素 利用率，提高茶叶品质，具有重要的理论和现实意义。 硝态氮转运蛋白（Nitrate transporters, NRTs)负责植物根系对NO3-的吸收和 转运，一直是植物营养领域研究热点之一。植物具有三个NO 3转运系统，以适应外界不同 的NO3浓度。两个高亲和运载系统（High-affinity transport system, HATS)，当外界 NO3的浓度低于lmmol/L时发挥作用，而当外界NO13的浓度高于lmmol/L时，植物通过低 亲和运载系统（Low-affinity transport system, LATS)进行 NO3 的吸收（Dechorgnat et al.，2010;Gojon et al.，2011)。目前，已证实拟南芥基因组有53个NRTl亚家族成员，7个 NRT2 亚家族成员（Okamato et al. ,2003 ;0rsel et al. ,2002)，水稻中 NRTl 亚家族成员有 100 多个，NRT2 亚家族成员为 6 个（Araki&Hasegawa, 2006) 〇 茶树吸收利用氮素的生理特性已有研究，但对于氮吸收转运蛋白特性的研究仍较 为缺乏，对茶树NRT2家族基因研究已有报道（冯素花等，2014 ;汪进等，2014)，而对茶树 NRTl家族分子的报道极少。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供茶树NRTl基因序列、蛋白结构及基因表达方法。 本专利技术采用的技术方案为：一种茶树NRTl基因，其特征在于：其序列如SEQ ID No. 1所示。 本专利技术还公开了一种茶树NRTl蛋白，其特征在于：其序列如SEQ ID No. 2所示。 进一步的，所述茶树NRTl蛋白所对应的氨基酸数目为595个，分子量为65912. 9， 理论等电点为8. 99,负电荷氨基酸残基数为40个，正电荷氨基酸残基数为49个，不稳定系 数为32. 96,为稳定蛋白，脂肪系数为101. 92,总平均亲水性为0. 315。 进一步的，所述茶树NRTl蛋白序列跨膜螺旋区位置分别在41-63, 78-100, 107-12 9, 149-171，192-214, 218-240, 340-362, 380-402, 423-442, 462-484, 505-527, 547-569。 本专利技术还公开了上述茶树NRTl基因表达方法，其步骤包括： (1)合成引物序列NRTlF和NRT1R，其中NRTlF的序列如SEQ ID No. 3所示，NRTlR 的序列如SEQ ID No. 4所不； ⑵实时定量PCR扩增出茶树NRTl基因全长序列，反应产物经I. 0%琼脂糖凝胶 电泳回收； (3)回收产物连接pMD18-T载体并转化大肠杆菌DH5a ; 进一步的，所述步骤（2)中PCR体系反应体系为25 μ L，其中10 X Taq plus buffer 2.5yL，25mM MgCl21.5yL，10mM dNTP 14 1^，1〇4]?正向引物141^1(^]\1反向引物141^ 模板 I μ L，灭菌 H20 16. 75 μ L，5U/ μ L 的 Taq plus DNA polymerase 0· 25 μ L ;PCR 反应条 件为：941€5111丨11，941€3〇8,54 1€3〇8,721€6〇8,30个循环；72。(：1〇11^11。 茶树NRTl基因序列全长为1880bp，编码595个氨基酸，其蛋白质分子量为 65. 92kD，理论等电点为9. 07043。含有12个跨膜螺旋区，其中，第6个和第7个跨膜结构域 之间存在一个大的亲水环。且该蛋白为亲水性蛋白。在茶树根和叶中均有表达，说明茶树 NRTl为组成型基因。茶树NRTl在茶树根系和叶部开始吸收NO3，5min内表达均受到抑制， 叶片中NRTl短时间内可以达到较高水平，而根部一直低于对照，96h才显著提高，表明茶树 NRTl受到了外界NO3的抑制，且这种抑制作用对根部影响较大，而对叶片中影响较小，说明 茶树不同组织部位中，吸收同化NO 3的机理可能存在差异，也说明NRTl不仅只作为硝酸盐 转运蛋白，其更可能是感受硝酸盐的信号受体。【附图说明】 图1为茶树NRTl基因 PCR扩增电泳图。 图2为NO3处理后茶树根和叶中NRTl基因相对表达量。 图3为茶树NTRl蛋白跨膜结构模式图。 下面结合附图对本专利技术的实施方式做进一步说明。【具体实施方式】 实施例1 茶树NRTl基因表达方法，其步骤包括： (1)合成引物序列NRTlF和NRT1R，其中NRTlF的序列如SEQ ID No. 3所示，NRTlR 的序列如SEQ ID No. 4所不； (2)实时定量PCR扩增出茶树NRTl基因全长序列，PCR体系反应体系为25 μ L， 其中10\丁&1口1118 1311打6『2.5 4 1^，2511111%(：121.5 4 1^，1〇1111(1犯1314 1^，1(^]\1正向引 物 1μL，10μΜ反向引物 lyL，模板 lyL，灭菌 Η20 16.75 yL，5U/yL 的 Taq plus DNA 口〇171^抑86 0.25以1^屮〇?反应条件为：941€511^11，941€308,54 1€308,721€608,30个循环； 72°C IOmin ;反应产物经1. 0%琼脂糖凝胶电泳回收，PCR扩增电泳图见图1 ; (3)回收产物连接pMD18-T载体并转化大肠杆菌DH5a ; 实施例2 分别提取茶树根和叶片中的RNA进行实时荧光定量RT-PCR分析，结果如图2所 示，与对照相比，茶树受NO 3处理5min后根和叶的NRTl表达量均显著下降。根部表达量始 终低于对照，48h后增加，96h达到最高值。叶部NRTl表达量半小时后显著高于对照，之后 一直保持"降-升-降"的规律。 <110 江.1:簣农业科学:院 <?20 茶树NRTi S因、蛋白及基因丧达方法 4； \210 1 <2ii mm <212 DM \213 Camellia sinensis (L. ) 0. Kuntze <400 I I gtttRgcccc ctt tttcttc attcat tcnc iacgf^cccaa ct ^ctaglaa agrttgataa 61 cecccgangc cla L^cddca hat^gcaclc ccigHHacac ,idCHhggc Lc ta本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种茶树NRT1基因，其特征在于：其序列如SEQ ID No.1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杨亦扬，王枫，胡雲飞，万青，李荣林，阮建云，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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