用于使用核苷酸缀合物的免疫测定的方法和设备技术

技术编号:12996664 阅读:91 留言:0更新日期:2016-03-10 11:19
用于免疫测定设备和方法的物质组合物,其包含共价地连接至第一核苷酸的信号抗体,例如,FAB片段;和一个或多个信号元件,例如信号酶(例如ALP)或荧光染料,各自共价地连接至第二核苷酸,其中第一核苷酸具有一个或多个重复序列,并且第二核苷酸与所述第一核苷上的一个或多个重复序列之一结合,以及其中信号抗体与信号元件的比率受重复序列的数目控制。

【技术实现步骤摘要】
【专利说明】用于使用核苷酸缀合物的免疫测定的方法和设备 本申请是申请日为2009年12月30日、申请号为200980153231. 3、专利技术名称为"用 于使用核苷酸缀合物的免疫测定的方法和设备"的专利技术专利申请的分案申请。 引用参考相关申请 本申请要求2008年12月31日提交的美国临时申请号61/142, 048的优先权,将 其通过引用以其全部并入本文。 专利技术背景 专利
本专利技术涉及使用核苷酸缀合物进行各种用于确定分析物在样品中的存在的测定 的方法和设备。 背景信息的讨论 -些低浓度靶分析物的检测对于一些疾病的早期诊断是重要的。例如,最近的研 究暗示测量水平低于典型商业测定水平的心肌肌钙蛋白I(cTnl)为临床医生提供了有价 值的信息。注意,甚至极低水平(即低于被认为指示急性心肌梗塞的水平)的cTnl可预示 着将来不利的心血管状态。例如,Zethelius等人,(2006,"Troponin I as a predictor of Coronary Heart Disease and Mortality in 7〇-year-old men:Acommunity-based cohort study", Circulation,第113卷:1071-1078)进行了研究以调查心脏Tnl浓度与未 来冠状动脉心脏病的预测之间的关系。他们观察到在未显示心脏血管疾病的临床迹象但展 现轻微升高的心脏Tnl水平的70岁老年男性中,可预测即将出现的冠状动脉心脏病事件。 此外,Apple 等人,(2008,"Use of the Centaur Tnl-Ul tra Assay for Detection of Myocardial Infarction and Adverse Events in Patients Presenting With Symptoms Suggestive of Acute Coronary Syndrome',, Clinical Chemistry,第 54 卷(4) : 723-728) 在灵敏肌钙蛋白测定中进行了研究以评估基于检测极限处的cTnl值和第99个百分位参 考值而评估短期不利事件的风险的预后价值。他们推断"我们的数据增加了日益增加的证 据:使用改进的分析上强劲的、具有低LoD的cTn测定,与低于测定的LoD的 cTnl浓度相比,任何可测量的cTnl意味着更高的风险。"目前的即时护理(point-of-care)免疫测定技术,尽管其测量各种靶分析物的存 在和浓度的能力是具有高度价值的,但其在可靠地检测极低水平的靶分析物例如cTnl的 能力上比较有限。因此,存在对可靠地检测低水平靶分析物例如cTnl的需要,特别是在即 时护理免疫测定分析物检测设备中。 美国专利No. 7, 419, 821 (将其全部通过引用而并入本文)利用了夹心测定法,其 中将两种捕获抗体固定在电极上并且用信号酶(例如碱性磷酸酶(ALP))标记两种信号抗 体(例如FAB(片段抗原结合)抗体片段)以形成信号缀合物。分析物(例如抗原(例如 cTnl))与捕获抗体和信号抗体结合以形成夹心测定,该测定提供了表示分析物存在的信 号。常规地,通过交联技术使信号抗体与信号酶结合以形成信号缀合物。这些合成条件导 致下列的宽泛范围:信号抗体与标记酶的比率,以及信号酶的数量/信号缀合物,和信号抗 体的数量/缀合物。例如,对于FAB抗体片段,通常存在具有从无(O)FAB/信号缀合物-估 计15个FAB/信号缀合物的信号缀合物统计群体。因此,通常通过尺寸排阻层析纯化合成 的信号缀合物来产生具有更窄范围的信号抗体(例如FAB分子)/信号缀合物的信号缀合 物群体。然而,此类纯化技术不合期望地导致减少的可预测性以及下列的可变比率:(i)信 号抗体与信号酶(例如,FAB与ALP) ;(ii)信号酶与信号缀合物;和(iii)信号抗体与信号 缀合物。这些可变比率限制了夹心测定可靠地检测样品中极低水平的靶分析物的能力。 用于评估样品(包括体液和环境样品)中分析物(例如抗原分子)的浓度的基于 酶联免疫吸附测定(ELISA)的测定通常需要将信号抗体共价地连接至信号酶以产生测定 的检测组分的能力。该技术的历史和综述可见于Lequin (2005, Enzyme Immunoassay (EIA) / Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA),Clinical Chemistry,第 51 卷 (12) :2415-2418)中。存在对增加ELISA测定的灵敏度的需要,因为一些抗原以极低的浓度 存在。 美国专利No. 5, 164, 311公开了通过将硫氢基添加至抗体以及将马来酰亚胺基 添加至酶以产生经修饰的抗体和酶,并使经修饰的抗体与酶反应以产生缀合物来产生抗 体-酶缀合物。如此,'311专利提出:"提供下列标记系统将是有利的:其中直接抗体-酶 缀合物可实现高的酶与抗体的比率,并从而提供接近或等于抗生物素蛋白-生物素标记系 统的更高程度的灵敏度。此种改进的直接抗体-酶缀合物将不需要如生物素-抗生物素蛋 白标记系统所需要的额外的温育步骤和洗涤步骤"。'311专利描述了对于酶-抗体缀合物 使用含有具有交联硫氢基和马来酰亚胺基能力的交联分子的交联剂(例如SPDP),然而在 其用于合成寡核苷酸方面没有记载。 已开发了用于DNA杂交技术(如Southern杂交)的分子生物学应用的、基于 酶和合成寡核苷酸的缀合物的合成(Reyes&Cockerell,1993,"Preparation of pure oligonucleotide-alkaline phosphatase conjugates',,Nucleic Acids Research, vol 21 (23) : 5532-5533)。此类缀合物的所述应用没有预见其用于基于ELISA的测定。 随着极灵敏的DNA扩增策略(例如美国专利No. 5, 656, 493及其它文献所涉及 的聚合酶链式反应(PCR))的发展,已认识到ELISA和PCR的组合可增加检测灵敏度。例 如,Sano 等人,(2000,''Immuno-PCR: very sensitive antigen detection by means of specific antibody-DNA conjugates, Science,第 258 卷(5079):120-122)描述了该策略 用于抗原检测的最早的应用之一。存在许多关于该方法的应用的参考文献,包括Kozlov 等人,(2004,"Efficient strategies for the conjugation of oligonucleotides to Antibodies Enabling Highly Sensitive Protein Detection',,Biopolymers,第 73 卷:621-630),他们描述了合成寡核苷酸抗体缀合合成策略以及此类特异性缀合物用于高 灵敏度检测的应用。该方法与本专利技术不同,因为合成寡核苷酸被用于随后的DNA扩增,而这 用作灵敏的检测方法。 DNA扩增(例本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于进行免疫测定的一次性盒,其包括:用于接受怀疑含有靶分析物(201)的生物样品的样品入口(4);包含电极(205)的管道(15);包含具有共价连接的抗体(204)的羧基衍生的聚苯乙烯珠(203)的捕获珠(202),其中所述捕获珠(202)位于所述电极(205)的上方;共价连接至第一单链核苷酸(210/313)的第一抗体种类(206/302);和多个各自连接至具有所述第一单链核苷酸(210/313)的互补碱基对的第二单链核苷酸(211/314)的信号元件(207/307),其中所述第一抗体种类(206/302)在所述样品入口(4)的下游位置处被置于处于所述管道(15)内的增溶剂中,并且其中所述第一单链核苷酸(210/313)包含至少三个重复序列,所述至少三个重复序列被构造成结合具有至少三个所述多个信号元件(207/307)的至少三个所述第二单链核苷酸(211/314)。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员:G·B·科里尔C·J·米勒
申请(专利权)人:雅培医护站股份有限公司
类型:发明
国别省市:美国;US

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