孤星病毒制造技术

本公开内容涉及独特的白蛉病毒—孤星病毒—的分离、鉴定、测序。本申请公开了孤星病毒核酸分子、蛋白质和抗体。本申请还公开了检测、诊断和治疗孤星病毒的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关专利申请的交叉引用本申请要求于2013年4月26日提交的美国申请No.61/816,634和于2013年4月19日提交的美国申请No.61/814,181的优先权，所述申请以引用的方式全文纳入本文。
本公开内容涉及独特的白蛉病毒(Phlebovirus)——孤星病毒(LoneStarVirus)——的分离、鉴定和测序，以及孤星病毒核酸分子、蛋白和抗体在检测和治疗中的用途。政府资助本专利技术是在国立卫生研究院(NIH)授予的基金No.R56-AI089532和R01-HL105704(来自用于婢传播的疾病的NationalResearchFund的研究基金，以及来自疾病控制中心的基金)的政府资助下完成的。政府对本专利技术享有某些权利。
技术介绍
布尼亚病毒科(Bunyaviridae)是最大的病毒家族，有超过350个感染大范围宿主的种，所述宿主包括植物、节肢动物、以及脊椎动物(WalterandBarr(2011)JGenVirol92:2467-2484)。布尼亚病毒科中的病毒感染大范围的植物、昆虫、以及动物宿主。布尼亚病毒科包括五个属：内罗病毒属(Nairovirus)，布尼亚病毒属(Bunyavirus)，汉坦病毒属(Hantavirus)，白蛉病毒属(Phlebovirus)和番茄斑萎病毒属(Tospovirus)(Guuetal.(2012)AdvExpMedBiol726:245-266)。它们的基因组由三个单链负义RNA片段组成：大的(L)，编码L蛋白，一种依赖RNA的RNA聚合酶(RdRp)；中等的(M)，编码糖蛋白Gn和Gc；小的(S)，编码核壳蛋白N和病毒子集中的一种双义非结构蛋白(NS)。最近，新出现的布尼亚病毒(推定其为蜱传播的)已经被发现与人类急性发热性疾病相关，其包括中国的发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)和美国的哈特兰病毒(Heartlandvirus)。对人类致病性的布尼亚病毒也与呼吸疾病和出血性疾病相关。这些布尼亚病毒包括克里米亚刚果出血热(CCHF)病毒(Ergonul,(2012)CurrOpinVirol2:215-220)——一种在亚洲、欧洲、非洲中病死率最高达30％的蜱传播的急性出血性疾病，以及汉坦病毒(Jonssonetal.(2010)ClinMicrobiolRev23:412-441)——一系列与肺炎或肾病综合征出血热相关的全球范围的啮齿动物传播的疾病。2011年，白蛉病毒属中的一种新的布尼亚病毒——命名为发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)——在中国被报道为严重发热病爆发的原因(Xuetal.(2011),PLoSPathog7:el002369；Yuetal.(2011)NEnglJMed364:1523-1532；Zhangetal.(2012)ClinInfectDis54:527-533)。在2008和2010年间，约有500名来自中国东部的患者——主要为湖北省和河南省的农村丘陵地区的农民——被诊断为SFTSV感染。由SFTSV引起的疾病的特征为发烧，食欲不振，疲劳，以及减少的血小板和白细胞计数(Zhangetal.,2012，见上文)。由于SFTS疾病的临床症状与在人粒细胞无形体病中见到的那些类似，该病原体最初被认为是嗜吞噬细胞无形体(Anaplasmaphagocytophilum)。一种新的白蛉病毒被鉴定为SFTS的原因(Xuetal.,2011,见上文；Yuetal.,2011,见上文)，并且额外的发现暗示硬蜱——长角血蜱(Haemaphysalislongicornis)——为SFTSV的载体(Zhangetal.,2012,见上文)。哈特兰病毒(HRTV)——一种与LSV不同并且与来自密苏里的两例人严重发热病相关的蜱传播的白蛉病毒——也被报道(McMullanetal.(2012)NEnglJMed367:834-841)。本加病毒(Bhanjavirus，BHAV)和帕尔马病毒(Palmavirus，PALV)的毒株也已经被完全测序，并被发现构成蜱传播的白蛉病毒的新的分化枝(Dilcheretal.(2012)VirusGenes45:311-315；Matsunoetal.(2013),JVirol.)。尽管BHAV组病毒的病原谱尚未被完全定义，但是Bhanja病毒在实验室和天然感染的病例中都与具有中枢神经系统病变(centralnervoussysteminvolvement)的发热病相关(参见如CalisherandGoodpasture(1975)AmJTropMedHyg24:1040-1042；Pundaetal.(1980)ZentralblattfurBakteriologie:297-301；Vesenjak-Hirjanetal.(1980)，FirstnaturalclinicalhumanBhanjavirusinfection.ZentralblattfurBakteriologie：297-301)。仍需要可用于检测和治疗白蛉病毒感染的试剂。
技术实现思路
本专利技术公开了之前未鉴定的白蛉病毒的分离与鉴定。具体地，公开了从孤星蜱——美洲钝眼蜱(Amblyommaamericanum)——中分离的白蛉病毒。进一步公开了这个孤星病毒(LSV)的基因组序列，以及由该病毒所编码的蛋白质的氨基酸序列。在一些实施方案中，公开了一种分离的白蛉病毒，其包括S片段，M片段和L片段，其中：(a)所述S片段的核苷酸序列与SEQIDNO:1至少80％相同；(b)所述M片段的核苷酸序列与SEQIDNO:2至少80％相同；(C)所述L片段的核苷酸序列与SEQIDNO:3至少80％相同；或(d)全部(a)、(b)和(c)。所述白蛉病毒可以是减毒的。在一些实施方案中，公开了分离的核酸分子，其包括与SEQIDNO:1、其互补物、SEQIDNO:2或SEQIDNO:3的开放阅读框至少90％相同的核酸序列。所述经分离的核酸分子可以包括如SEQIDNO:1、其互补物、SEQIDNO:2或SEQIDNO:3所示的核酸序列的开放阅读框。所述经分离的核酸分子可以为cDNA。公开了特异性针对这些核酸分子寡核苷酸，如引物和探针。还公开了由这些核酸分子所编码的多肽。这些多肽包括，但不限于，包含如SEQIDNO:4-7所示的氨基酸序列的多肽。在其他实施方案中，公开了特异性结合本文公开的LSV或由LSV所编码的多肽的分离本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的核酸分子，其包含与SEQ ID NO:1、其互补物、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的开放阅读框至少90％相同的核酸序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.04.19 US 61/814,181;2013.04.26 US 61/816,6341.一种分离的核酸分子，其包含与SEQIDNO:1、其互补物、SEQID
NO:2或SEQIDNO:3的开放阅读框至少90％相同的核酸序列。
2.权利要求1的分离的核酸分子，其包含如SEQIDNO:1、其互补
物、SEQIDNO:2或SEQIDNO:3所示的核酸序列的开放阅读框。
3.权利要求6的分离的核酸分子，其包含如SEQIDNO:1、SEQID
NO:2或SEQIDNO:3所示的核酸序列。
4.权利要求1的分离的核酸分子，其中所述核酸编码包含如SEQID
NO:4-7所示的氨基酸序列的多肽。
5.一种cDNA，其包含：
(a)与SEQIDNO:1、其互补物、SEQIDNO:2或SEQIDNO:3
的开放阅读框至少90％相同的核苷酸序列；
(b)如SEQIDNO:1、其互补物、SEQIDNO:2或SEQIDNO:3
所示的核酸序列的开放阅读框；或
(c)编码包含如SEQIDNO:4-7所示的氨基酸序列的多肽的核酸序
列。
6.一种分离的多肽，其由权利要求1-5中任一项的核酸分子所编码。
7.权利要求6的分离的多肽，其包含与如SEQIDNO:4-7之一所示
的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列。
8.权利要求7的分离的多肽，其包含如SEQIDNO:4-7之一所示的
氨基酸序列。
9.权利要求1-5中任一项的分离的核酸分子，其可操作地连接至异源
的启动子。
10.一种重组载体，其包含权利要求9的核酸分子。
11.一种分离的宿主细胞，其包含权利要求1-5或9中任一项的核酸
分子或权利要求10的载体。
12.一种长度为12到40个核苷酸的分离的寡核苷酸，其中所述寡核
苷酸在高度严格性的条件下与SEQIDNO:1、SEQIDNO:2或SEQID
NO:3、或它们的互补物之一特异性杂交。
13.权利要求12的分离的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括荧光团、

\t猝灭剂或两者。
14.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特异性结合：
(a)由与如SEQIDNO:1、其互补物、SEQIDNO:2或SEQIDNO:
3之一所示的核酸序列至少90％相同的核酸序列的开放阅读框所编码的氨
基酸序列；
(b)由与如SEQIDNO:1、其互补物、SEQIDNO:2或SEQIDNO:
3之一所示的核酸序列至少95％相同的核酸序列的开放阅读框所编码的氨
基酸序列；或
(c)由如SEQIDNO:1、其互补物、SEQIDNO:2或SEQIDNO:
3之一所示的核酸序列的开放阅读框所编码的氨基酸序列。
15.权利要求14的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片
段特异性结合如SEQIDNO:4-7之一所示的氨基酸序列。
16.权利要求14或15的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原
结合片段是经标记的。
17.权利要求14或15的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原
结合片段是嵌合的。
18.一种检测生物样品中的孤星病毒多肽的方法，其包括：
(a)使所述生物样品与分离的单克隆抗体或其抗原结合片段接触，
所述单克隆抗体或其抗原结合片段特异性结合：
(i)由与如SEQIDNO:1、其互补物、SEQIDNO:2或SEQID
NO:3之一所示的核酸序列至少90％相同的核酸序列的开放阅读框所
编码的氨基酸序列；
(ii)由与如SEQIDNO:1、其互补物、SEQIDNO:2或SEQID
NO:3之一所示的核酸序列至少95％相同的核酸序列的开放阅读框所
编码的氨基酸序列；或
(iii)由如SEQIDNO:1、其互补物、SEQIDNO:2或SEQID
NO:3之一所示的核酸序列的开放阅读框所编码的氨基酸序列；和
(b)检测所述抗体或抗原结合片段与所述生物样品的结合，其中所
述抗体或抗原结合片段与所述生物样品的结合指示所述生物样品中孤星
病毒或孤星病毒多肽的存在。
19.一种检测在生物样品中的孤星病毒特异性抗体的方法，其包括：
(a)使所述生物样品与多肽接触，所述多肽包含：
(i)由与如SEQIDNO:1、其互补物、SEQIDNO:2或SEQID
NO:3之一所示的核酸序列至少90％相同的核酸序列的开放阅读框所
编码的氨基酸序列；
(ii)由与如SEQIDNO:1、其互补物、SEQIDNO:2或SEQID
NO:3之一所示的核酸序列至少95％相同的核酸序列的开放阅读框所
编码的氨基酸序列；或
(iii)由如SEQIDNO:1、其互补物、SEQIDNO:2或SEQID
NO:3之一所示的核酸序列的开放阅读框所编码的氨基酸序列；
(b)检测所述多肽与所述生物样品的结合，其中所述多肽与所述生
物样品的结合指示所述生物样品中孤星病毒特异性抗体的存在。
20.权利要求19的方法，其包括使所述生物样品与多肽接触，所述多
肽包含如SEQIDNO:4-7之一所示的氨基酸序列。
21.一种检测在生物样品中的孤星病毒核酸分子的方法，其包括：
(a)使所述生物样品与长度为12到40个核苷酸的分离的寡核苷酸
接触，其中所述寡核苷酸在高度严格性的条件下与SEQIDNO:1、SEQID
NO:2或SEQIDNO:3之一特异性杂交；和
(b)检测探针与所述生物样品的杂交，其中所述探针与所述生物样
品的杂交指示所述生物样品中孤星病毒核酸分子的存在。
22.权利要求21的方法，其中所述生物样品是通过包括如下的方法获
得的核酸扩增产物：
(a)从所述生物样品中分离RNA；
(b)反转录所述RNA以生成cDNA；和
(c)使用与权利要求6的分离的核酸分子特异性杂交的一对引物扩增
cDNA，由此产生了核酸扩增产物。
23.一种鉴定感染孤星病毒的受试者的方法，其包括：
(a)从获自所述受试者的生物样品中分离RNA；
(b)反转录所述RNA以生成cDNA；
(c)使用与权利要求1-5中任一项的分离的核酸分子或其互补物特异
性杂交的一对引物扩增cDNA；和
(d)检测...

【专利技术属性】
技术研发人员：查尔斯·赵，A·斯韦，B·J·B·约翰逊，
申请(专利权)人：加利福尼亚大学董事会，美国政府由卫生和人类服务部的部长所代表，
类型：发明
国别省市：美国;US