一种高效表达多拷贝人表皮生长因子的方法技术

一种高效表达多拷贝人表皮生长因子的方法，通过在其基因片段的上游及下游引入限制酶酶切位点，经酶切、连接，得到人表皮生长因子成熟肽基因的串联重复序列，克服人表皮生长因子分子量小，表达量不够的问题，同时在人表皮生长因子基因片段的上游引入kex2酶切位点，在下游修改部分核苷酸碱基使原氨基酸序列羧基端ELR变为酵母菌kex2酶切位点，以保证重组表达的目的蛋白经由酵母固有的kex2酶切割为单体，显著提高表达量，并具有天然的N末端，C端只有一个氨基酸残基的差异却没有冗余氨基酸，而活性却没改变，因其在毕赤酵母中自然合成，可以保持蛋白质原有的天然状态的空间构象，进而实现了人表皮生长因子的高效规模化制备。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程技术，具体涉及一种高效表达多拷贝人表皮生长因子的方法。
技术介绍
随着基因工程技术的发展，一些具有生物活性的小分子多肽受到高度重视。人表皮生长因子(humanepidermalgrowthfactor，hEGF)，又称尿抑胃素，是一种由53个氨基酸组成的约6kD的多肽，主要在十二指肠Brunner氏腺中产生。hEGF在临床医学领域的应用主要是：(1)促进外科手术伤口及难愈合创面的愈合。近年来，hEGF在人体烧伤、创伤、糖尿病性皮肤溃疡、褥疮、静脉曲张性皮肤溃疡上的应用较为广泛，并获得良好效果。(2)促进眼角膜创伤的愈合。EGF能促进角膜上皮细胞的增殖以用来治疗角膜损伤、溃疡、酸碱烧伤以及促进移植角膜的存活。(3)对胃肠道溃疡的治疗作用。hEGF有抑制胃酸分泌，防止胃、十二指肠粘膜损伤及促进胃、十二指肠溃疡愈合的作用。(4)抗肿瘤作用。此外，hEGF在化妆品领域也有很宽广的应用前景。目前，作为活性多肽的人表皮生长因子的制备多采用生物提取、化学合成或者基因重组的方法。应用基因工程方法制备重组人表皮生长因子已有大量报道，但以往的表达都是单拷贝，即使在拷贝丰富的菌株中，由于人表皮生长因子分子量很小，表达量也不能达到满意的效果，造成宿主表达潜能浪费，产量较低。将多肽基因进行串联表达可解决单拷贝表达产量低的原因：(1)串联增加了多肽基因数量，有利于提高表达量；(2)串联多聚体形式的表达可有效屏蔽宿主毒性；(3)多聚体表达产物更稳定。因此，对人表皮生长因子采用构建多聚体的方法对于提高表达量具有突出的优势。<br>
技术实现思路
本专利技术的目的就在于为解决现有技术的不足而提供一种高效表达多拷贝人表皮生长因子的方法。本专利技术的目的是以下述技术方案实现的：一种高效表达多拷贝人表皮生长因子的方法，包括以下步骤：（1）人表皮生长因子基因片段的获得：设计引物，在人表皮生长因子基因上游引入限制性内切酶酶切位点和酵母菌kex2酶切位点，在下游修改部分核苷酸碱基使原氨基酸序列羧基端ELR变为酵母菌kex2酶切位点EKR，并引入限制性内切酶酶切位点，PCR扩增出目的片段；（2）人表皮生长因子定向多拷贝克隆：步骤（1）中扩增出的目的片段经限制性内切酶酶切、连接，得到目的基因的定向多拷贝克隆；（3）人表皮生长因子定向多拷贝克隆的酵母表达：将步骤（2）得到的定向多拷贝克隆转化至毕赤酵母中培养，经酵母菌本身的kex2酶自剪切，获得重组的目的蛋白单体。步骤（1）中人表皮生长因子基因上游引入的限制性内切酶酶切位点为EcoRI和Bg1II；下游引入的限制性内切酶酶切位点为BamHI、NotI、SalI。所述步骤（1）中的引物为：所述步骤（1）为：将引物通过SOE法获得人表皮生长因子基因片段。所述步骤（2）为：将步骤（1）获得的目的片段经EcoRI和SalI双酶切，与同样双酶切的质粒PUC57连接，构建的质粒记作PUC57-hEGF，PUC57-hEGF经BglII/NotI双酶切后回收hEGF片段；同时经BamHI/NotI，双酶切后回收PUC57-hEGF片段，将回收的目的片段经T4连接酶连接，连接混合物转化至大肠杆菌DH5α中，筛选得到2拷贝人表皮生长因子串联基因；在此基础上，继续进行酶切、连接可分别得到3拷贝、4拷贝、5拷贝的人表皮生长因子串联基因。步骤（3）为：将步骤（2）获得的含有人表皮生长因子1-5串联基因的质粒分别经EcoRI/NotI双酶切，与同样双酶切的pPIC9K载体连接，经电转化至毕赤酵母GS115，筛选得到阳性重组子，然后进行诱导表达，获得重组的目的蛋白单体。本专利技术通过在人表皮生长因子基因片段的上游及下游引入限制酶酶切位点，经酶切、连接，得到人表皮生长因子成熟肽基因的串联重复序列，克服人表皮生长因子分子量小，表达量不够的问题，同时在人表皮生长因子基因片段的上游引入kex2酶切位点，在下游修改部分核苷酸碱基使原氨基酸序列羧基端ELR变为酵母菌kex2酶切位点(EKR)，由于kex2酶切位点为酵母本身的蛋白酶kex2裂解位点，以保证重组表达的目的蛋白经由酵母固有的kex2酶切割为单体，显著提高表达量，而无需其它酶的切割处理，并具有天然的N末端，C端只有一个氨基酸残基的差异却没有冗余氨基酸，而活性却没改变，因其在毕赤酵母中自然合成，可以保持蛋白质原有的天然状态的空间构象，进而实现了人表皮生长因子的高效规模化制备。附图说明图1是人表皮生长因子基因克隆至pMD19-T载体的检测结果；M：DNAmarker；1-5：随即挑选的阳性克隆子菌液PCR结果；图2是人表皮生长因子基因2-4拷贝串联序列的克隆的检测结果；M：DNAmarker；1：PUC57-2hEGF质粒PCR结果；2-3：PUC57-3hEGF阳性克隆子菌液PCR结果；4-7：PUC57-4hEGF阳性克隆子菌液PCR结果。图3是hEGF基因5拷贝串联序列的克隆的检测结果；M：DNAmarker；1：PUC57-4hEGF质粒PCR结果；2-4：PUC57-5hEGF阳性克隆子菌液PCR结果；图4是hEGF基因克隆至pPIC9K载体的检测结果；M：DNAmarker；1-5：随即挑选的阳性克隆子菌液PCR结果；6：空载pPIC9K载体PCR结果；图5是2拷贝hEGF基因克隆至pPIC9K载体的检测结果；M：DNAmarker；1-6：随即挑选的pPIC9K-2hEGF阳性克隆子菌液PCR结果；7：pPIC9K-hEGF质粒PCR结果；图6是3-4拷贝hEGF基因克隆至pPIC9K载体的检测结果；M：DNAmarker；1-4：随即挑选的pPIC9K-3hEGF阳性克隆子菌液PCR结果；5-9：随即挑选的pPIC9K-4hEGF阳性克隆子菌液PCR结果；图7是hEGF基因5拷贝串联序列的克隆检测结果；M：DNAmarker；1-4：pPIC9K-5hEGF阳性克隆子菌液PCR结果；图8是EGF1-5串联表达载体EcoRI/NotI双酶切鉴定；M：DNAmarker；1-5：1-5串联表达载体双酶切结果；图9是单拷贝重组表皮生长因子的Tricine-SDS-PAGE分析结果；M：Proteinmolecularmarker；1-4：菌落1分别诱导24、48、72和96h表达结果；图10是2拷贝重组表皮生长因子的Tricine-SDS-PAGE分析结果；M：Proteinmolecularmarker；1-4：菌落1分别诱导24、48、72和96h表达结果；图11是3拷贝重组表皮生长因子的Tricine-SDS-PAGE分析结果；M：Proteinmolecularmarker；1-4：菌落1分别诱导24、48、72和96h表达结果；图12是4拷贝重组表皮生长因子的Tricine-SDS-PAGE分析结果；M：Proteinmolecularmarker；1-4：菌落1分别诱导24、48、72和9本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高效表达多拷贝人表皮生长因子的方法，其特征在于包括以下步骤：（1）人表皮生长因子基因片段的获得：设计引物，在人表皮生长因子基因上游引入限制性内切酶酶切位点和酵母菌kex2酶切位点，在下游修改部分核苷酸碱基使原氨基酸序列羧基端ELR变为酵母菌kex2酶切位点EKR，并引入限制性内切酶酶切位点，PCR扩增出目的片段；（2）人表皮生长因子定向多拷贝克隆：步骤（1）中扩增出的目的片段经限制性内切酶酶切、连接，得到目的基因的定向多拷贝克隆；（3）人表皮生长因子定向多拷贝克隆的酵母表达：将步骤（2）得到的定向多拷贝克隆转化至毕赤酵母中培养，经酵母菌本身的kex2酶自剪切，获得重组的目的蛋白单体。

【技术特征摘要】
1.一种高效表达多拷贝人表皮生长因子的方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）人表皮生长因子基因片段的获得：设计引物，在人表皮生长因子基因上游引入限制性内切酶酶切位点和酵母菌kex2酶切位点，在下游修改部分核苷酸碱基使原氨基酸序列羧基端ELR变为酵母菌kex2酶切位点EKR，并引入限制性内切酶酶切位点，PCR扩增出目的片段；
（2）人表皮生长因子定向多拷贝克隆：步骤（1）中扩增出的目的片段经限制性内切酶酶切、连接，得到目的基因的定向多拷贝克隆；
（3）人表皮生长因子定向多拷贝克隆的酵母表达：将步骤（2）得到的定向多拷贝克隆转化至毕赤酵母中培养，经酵母菌本身的kex2酶自剪切，获得重组的目的蛋白单体。
2.如权利要求1所述的高效表达多拷贝人表皮生长因子的方法，其特征在于：步骤（1）中人表皮生长因子基因上游引入的限制性内切酶酶切位点为EcoRI和Bg1II；下游引入的限制性内切酶酶切位点为BamHI、NotI、SalI。
3.如权利要求2所述的高效表达多拷贝人表皮生长因子的方法，其特征于所述步骤（1）中的引物为：
Oligo1：tagaattcagatctgagaaaagaaactctgactctgagtg；
Oligo2：aactctgactctgagtgtccattgtcccacgacggttactgtttgcac；
Oligo3：agcgtacttgtccaaagcttcgatgtacatacagacaccgtcgtgcaaacagtaaccgt；
Oligo4：ctttggac...

【专利技术属性】
技术研发人员：凡复，任宏伟，刘艳生，
申请(专利权)人：安阳工学院，
类型：发明
国别省市：河南;41