抗CXCL1、CXCL7和CXCL8抗体及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种分离的抗体或其片段，其针对人的趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8，正如通过表面等离子体共振所确定的，所述抗体或其片段能够以至多16nM的平衡解离常数(KD)结合人趋化因子CXCL1、以至多5nM的平衡解离常数(KD)结合人趋化因子CXCL7以及以至多45nM的平衡解离常数(KD)结合人趋化因子CXCL8。本发明专利技术还提供所述分离的抗体的一些应用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及预防和治疗趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8相关疾病的领域，尤其是病理性血管生成性疾病的领域。具体地，本专利技术涉及针对趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8的抗体，以及它们的应用，特别是用作药物用于治疗和/或预防趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8相关的疾病，尤其是病理性血管生成性疾病。
技术介绍
在20世纪70年代早期，JudahFolkman提出靶向血管生成来治疗癌症。许多临床前研究和临床研究证实了这种最初的假设，并且导致许多治疗性化合物的开发，包括人源化的单克隆抗体和大量激酶抑制剂。血管生成最重要的因子之一是VEGF(血管内皮生长因子)。几乎在VEGF发现的20年后，贝伐单抗(Hurwitz等人，2004)(一种靶向VEGF的人源化单克隆抗体)才得到了食品与药物监督管理局(FDA)的批准，联合标准的化疗剂伊立替康用于治疗结肠癌。也已经开发了其它许多抗血管生成的化合物，包括酪氨酸激酶受体抑制剂，如苹果酸舒尼替尼(Choueiri等人，2008)和索拉非尼甲苯磺酸盐(酯)(Eisen等人，2008)，还有细胞内激酶的抑制剂，如坦西莫司(Motzer等人，2008)和非受体丝氨酸苏氨酸激酶抑制剂。尽管采用这些疗法使得无进展生存显著增加，仍观察到了不可避免的复发和疾病发展成为死亡。一些最近的论文描述了一种称作治疗逃逸(treatmentevasion)的新现象，以及在使用酪氨酸激酶抑制剂进行治疗的情况下选择具有增加转移潜能的更加侵袭性的细胞(Ebos等人，2009，Paez-Ribes等人，2009)。以这种方式，靶向VEGF用于RCC抗血管生成疗法；然而，单独靶向VEGF仅仅有一部分取得成功。尽管使用VEGF的中和性人源化抗体(即贝伐单抗)显著增加了无进展生存(Yang等人，2003)(Escudier等人，NEJM2007)，2009年ASCO会议上提出的关键AVOREN研究中报道在安慰剂和贝伐单抗治疗的患者之间没有显著差异(Escudier等人，2010)。不同的机制都可能引起治疗逃逸，包括血管生成冗余、或者由于存在VEGF的抗血管生成形式(称为VEGFxxxb)而导致的无疗效(inefficacy)，该VEGF的抗血管生成形式是VEGF前mRNA的选择性剪接所导致的(Harper,2008)。WO2008/130969公开了通过将所述五种抗原的混合物注射至小鼠而得到的单克隆抗体，所述抗体能够结合五种抗原：人IL-8(CXCL8)、Gro-α(CXCL1)、Gro-β(CXCL2)、Gro-γ(CXCL3)和ENA-78(CXCL5)，并公开了所述抗体在非人灵长类动物的吸入性LPS急性肺部炎症模型中的用途。然而，WO2008/130969没有披露结合CXCL1、CXCL7和CXCL8的单克隆抗体。WO2011/100271公开了能够结合人IL-8(CXCL8)、Gro-α(CXCL1)、Gro-β(CXCL2)、Gro-γ(CXCL3)、GCP2、NAP2(CXCL7)和ENA-78(CXCL5)的单克隆抗体。然而，WO2011/100271没有公开所述单克隆抗体针对所述抗原的亲和性。因此，本领域仍然明显需要新型的且改进的抗血管生成化合物，其增加患者寿命并避免复发和疾病进展到死亡。通过本文所公开的本专利技术，本专利技术人向前迈出了显著的一步。本专利技术的目的在于通过提供新型化合物来满足这种需要，所述的化合物使得能够解决全部或部分上述问题。出乎意料地，本专利技术人证实他们新开发的针对趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8的抗体能够有效地抑制肿瘤的生长，特别是在RCC的小鼠模型中(透明细胞型肾细胞癌)。RCC是用于研究抗血管生成疗法最相关的模型之一，因为RCC是高度血管化的肿瘤(由于vonHippelLindau基因中的突变而产生)。这些结果是出乎意料的，因为最近的几篇论文描述抑制趋化因子(包括CXCL8)不能抑制反而促进肿瘤生长。在这方面，Yao等人(2007)证明了CXCL-8的抑制促进裸鼠体内的肿瘤生长。令人惊奇的是，这些新开发的抗体能够比单独或组合使用的市售抗CXCL1、抗CXCL7和抗CXCL8抗体更有效地抑制肿瘤的生长。这些结果真是令人惊奇，因为本专利技术人证明市售抗CXCL7和抗CXCL8抗体的组合(有或没有市售抗CXCL1抗体)对肿瘤生长的抑制不能够获得加和的效果。与此相反，本专利技术人已经表明在肿瘤生长的抑制方面，市售抗CXCL7和抗CXCL8抗体的组合使用没有单独使用它们时有效，并在RCC小鼠模型中具有促肿瘤效应。
技术实现思路
因此，在一方面，本专利技术涉及分离的抗体或其片段，其针对人趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8，正如通过表面等离子体共振所确定的，尤其是在25℃，更特别是根据实施例中描述的等离子体共振分析，所述的抗体或其片段能够以至多16nM的平衡解离常数(KD)结合人趋化因子CXCL1、以至多5nM的平衡解离常数(KD)结合人趋化因子CXCL7以及以至多45nM的平衡解离常数(KD)结合人趋化因子CXCL8。可以通过用肽免疫动物(如大鼠)来获得本专利技术的抗体，其中所述的肽是人CXCL7所特异的，但是和人CXCL1和8具有相似性，尤其是使用序列SDLYAELRCMCIKTTSGIHPKNIQS(SEQIDNO：20)的肽免疫动物，随后通过筛选方法分离抗体。可以使用不同的筛选方法来分离抗体，包括Bourcier等人描述的(2011)在偶联到钥孔血蓝蛋白的所述肽上面进行的ELISA测试、以及在表达CXCR2的细胞中抑制CXCL-7诱导的ERK激活的抗体能力的测试。在一个具体的实施方式，本专利技术还涉及通过包括以下步骤的方法获得的或者易于获得的抗体：i)用至少一种肽免疫至少一种动物，其中所述肽是人CXCL7所特异的，但是与人CXCL1和8具有相似性，尤其是采用序列SDLYAELRCMCIKTTSGIHPKNIQS(SEQIDNO：20)的肽，ii)通过本领域技术人员已知的任何方法产生单克隆抗体，比如从所述动物中分离B细胞，并将所述B细胞与骨髓瘤细胞融合形成能够分泌单克隆抗体的永生杂交瘤细胞，iii)进行筛选方法来分离能够结合序列SEQIDN°20的肽的抗体、或者能够结合偶联至钥孔血蓝蛋白的序列SEQIDN°20的肽的抗体、和/或能够在表达CXCR2的细胞中抑制CXCL-7诱导的ERK激活的抗体，特别是在Bou本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的抗体或其片段，其针对人趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8，正如通过表面等离子体共振所确定的，所述的抗体或其片段能够以至多16nM的平衡解离常数(KD)结合人趋化因子CXCL1、以至多5nM的平衡解离常数(KD)结合人趋化因子CXCL7以及以至多45nM的平衡解离常数(KD)结合人趋化因子CXCL8。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.05.17 EP 13305642.41.一种分离的抗体或其片段，其针对人趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8，
正如通过表面等离子体共振所确定的，所述的抗体或其片段能够以至多16nM的
平衡解离常数(KD)结合人趋化因子CXCL1、以至多5nM的平衡解离常数(KD)
结合人趋化因子CXCL7以及以至多45nM的平衡解离常数(KD)结合人趋化因
子CXCL8。
2.根据权利要求1所述的抗体，其中所述的轻链可变区(VL)包含：
-序列SEQIDNO:1的轻链CDR1(LC-CDR1)、或者在SEQIDNO:1的整
个长度范围内和SEQIDNO:1具有至少90％同一性的序列的轻链CDR1
(LC-CDR1)；以及
-序列SEQIDNO:2的轻链CDR2(LC-CDR2)、或者在SEQIDNO:2的整
个长度范围内和SEQIDNO:2具有至少90％同一性的序列的轻链CDR2
(LC-CDR2)；以及
-序列SEQIDNO:3的轻链CDR3(LC-CDR3)、或者在SEQIDNO:3的整
个长度范围内和SEQIDNO:3具有至少90％同一性的序列的轻链CDR3
(LC-CDR3)；以及
其中所述的重链可变区(VH)包含：
-序列SEQIDNO:4的重链CDR1(HC-CDR1)、或者在SEQIDNO:4的整
个长度范围内和SEQIDNO:4具有至少90％同一性的序列的重链CDR1
(HC-CDR1)；以及
-序列SEQIDNO:5的重链CDR2(HC-CDR2)、或者在SEQIDNO:5的整
个长度范围内和SEQIDNO:5具有至少90％同一性的序列的重链CDR2
(HC-CDR2)；以及
-序列SEQIDNO:6的重链CDR3(HC-CDR3)、或者在SEQIDNO:6的整
个长度范围内和SEQIDNO:6具有至少90％同一性的序列的重链CDR3
(HC-CDR3)。
3.根据权利要求1所述的抗体，其中所述的轻链可变区(VL)包含：
-序列SEQIDNO:7的轻链CDR1(LC-CDR1)、或者在SEQIDNO:7的整
个长度范围内和SEQIDNO:7具有至少90％同一性的序列的轻链CDR1
(LC-CDR1)；以及
-序列SEQIDNO:8的轻链CDR2(LC-CDR2)、或者在SEQIDNO:8的整
个长度范围内和SEQIDNO:8具有至少90％同一性的序列的轻链CDR2
(LC-CDR2)；以及
-序列SEQIDNO:9的轻链CDR3(LC-CDR3)、或者在SEQIDNO:9的整
个长度范围内和SEQIDNO:9具有至少90％同一性的序列的轻链CDR3
(LC-CDR3)；以及
其中所述的重链可变区(VH)包含：
-序列SEQIDNO:10的重链CDR1(HC-CDR1)、或者在SEQIDNO:10的
整个长度范围内和SEQIDNO:10具有至少90％同一性的序列的重链CDR1
(HC-CDR1)；以及
-序列SEQIDNO:11的重链CDR2(HC-CDR2)、或者在SEQIDNO:11的
整个长度范围内和SEQIDNO:11具有至少90％同一性的序列的重链CDR2
...

【专利技术属性】
技术研发人员：G·帕格斯，R·格雷潘，
申请(专利权)人：国家科学研究中心，尼斯大学，
类型：发明
国别省市：法国;FR