γ-聚谷氨酸的发酵制备及菌株制造技术

本发明专利技术提供了γ-聚谷氨酸的发酵方法和/或提高γ-聚谷氨酸发酵产量的方法，其包括将产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌（如，HBY-PBS-ZY55）接种入添加了正己烷、吐温-80和/或甜菜碱的发酵培养基中进行发酵培养，并任选在步骤（1）的发酵培养期间进一步添加正己烷。另外，本发明专利技术还提供了获得高产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌的方法和由该方法获得的菌株及其应用等。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于微生物发酵领域，具体而言，本专利技术涉及利用微生物发酵生产γ-聚谷氨酸的方法，另外本专利技术还涉及用于该方法中的优选的菌株等。
技术介绍
γ-聚谷氨酸(简称为γ-PGA或PGA)是谷氨酸单体以γ-位上的酰胺键聚合而形成的同质多肽。它具有水溶性，可生物降解，不含毒性，可广泛应用于食品工业、化妆品、保健、水处理、废水处理、卫生用品、医疗等领域，例如可以用作为增稠剂、冷冻保护剂、缓释剂、药物载体、生物粘合剂、保湿剂、生物可降解纤维、高吸水性树脂、生物絮凝剂和重金属离子吸收剂等。γ-聚谷氨酸的主要制备方法有：化学合成法，提取法，酶转化法和微生物发酵法。由于前三种方法产量低，成本较高，污染大，目前主要利用微生物发酵法来制备γ-聚谷氨酸。现有技术对利用微生物发酵生产γ-聚谷氨酸的关注点主要在于微生物生产菌种和菌株上，例如，中国专利申请第02151746号公开了枯草芽孢杆菌NX-2及利用其来制备γ-聚谷氨酸的方法；中国专利申请第200410010509号公开了枯草芽孢杆菌zju-7及利用其来制备γ-聚谷氨酸的方法；中国专利申请第200610155278号公开了利用枯草芽孢杆菌和谷氨酸棒杆菌混和制备γ-聚谷氨酸的方法；中国专利申请第200710130248号公开了枯草芽孢杆菌CGMCCNo.2108及利用其来制备γ-聚谷氨酸的方法，最高产量可达34.1g/L；中国专利申请第200810027184号公开了枯草芽孢杆菌PGA-7及利用其来制备γ-聚谷氨酸的方法，最高产量可达27.3g/L；中国专利申请第200810150830号公开了枯草芽孢杆菌XN01及利用其来制备γ-聚谷氨酸的方法；中国专利申请第201010271196号公开了枯草芽孢杆菌PGS-1及利用其来制备γ-聚谷氨酸的方法；中国专利申请第201210018185号公开了利用枯草芽孢杆菌SY-ND和巨大芽孢杆菌SY-Z5混和制备γ-聚谷氨酸的方法，进而用于生产微生物絮凝剂；中国专利申请第201210371764和201210371783号公开了枯草芽孢杆菌GXA-28及利用其来制备γ-聚谷氨酸的方法，产量可达20-30g/L；中国专利申请第201210555304号公开了基因工程重组VHb基因的枯草芽孢杆菌FRD518及利用其来制备γ-聚谷氨酸的方法，最高产量可达65g/L。本专利技术人发现，上述现有技术最为严重的一个缺陷是发酵时间都较长，要达到较高或最高产量，发酵时间需要长达48-96小时，非常不利于工业化生产。而本专利技术人没有受到上述现有技术关注方向的限制，令人意外地发现，正己烷、吐温-80和/或甜菜碱的加入，能够提升γ-聚谷氨酸的产量，尤其是提高短期发酵的产量，增幅最高可达20％以上；另外，根据本专利技术人筛选得到的枯草芽孢杆菌HBY-PBS-ZY55的使用以及针对其的补料发酵的优化，在不超过36小时(甚至28小时)的短期内的γ-聚谷氨酸产量可稳定达到36g/L以上。其中，枯草芽孢杆菌HBY-PBS-ZY55是没有转化过VHb基因的非基因工程菌，因此还有进一步基因改造提升产量的前景。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于提供新的γ-聚谷氨酸发酵方面的方法、应用和菌株等，尤其能够使其在短期内通过发酵培养即取得高产。具体而言，在第一方面，本专利技术提供了γ-聚谷氨酸的发酵方法，其包括：(1)将产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌(如，HBY-PBS-ZY55)接种入添加了正己烷、吐温-80和/或甜菜碱的发酵培养基中进行发酵培养；(2)任选在步骤(1)的发酵培养期间进一步添加正己烷；(3)收集发酵培养物中的γ-聚谷氨酸。相应地，在第二方面，本专利技术也提供了提高γ-聚谷氨酸发酵产量的方法，其包括：(1)将产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌(如，HBY-PBS-ZY55)接种入添加了正己烷、吐温-80和/或甜菜碱的发酵培养基中进行发酵培养；(2)任选在步骤(1)的发酵培养期间进一步添加正己烷；(3)收集发酵培养物中的γ-聚谷氨酸。本专利技术第二方面的方法能比相应的不添加正己烷、吐温-80和/或甜菜碱的方法获得更多γ-聚谷氨酸，在本专利技术的具体实施方式中，γ-聚谷氨酸发酵产量可提高20％以上。在本文中，产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌为本领域技术人员所知晓，例如本专利技术
技术介绍
部分所提及的，本专利技术优选采用的枯草芽孢杆菌将在下文中更详细地描述；枯草芽孢杆菌的发酵温度为本领域技术人员所知晓，为34-38℃，本专利技术优选采用36℃或36.5℃等。在本文中，术语“和/或”具有一般理解的意义，即并列关系是“和”或者是“或”的关系。例如，添加了正己烷、吐温-80和/或甜菜碱，可以是仅仅添加了正己烷，可以是仅仅添加了吐温-80，可以是仅仅添加了甜菜碱，可以是仅仅添加了正己烷和吐温-80，可以是仅仅添加了正己烷和甜菜碱，可以是仅仅添加了吐温-80和甜菜碱，也可以是添加了正己烷、吐温-80和甜菜碱。在本文中，如未特别指出培养基中的添加物，培养基仅仅是未添加相应添加物的培养基。例如，在本专利技术中，发酵培养的发酵培养基优选可以是如下配方(g/L)：葡萄糖60-80，果糖5-10，谷氨酸钠20-40，氯化钙1-1.5，K2HPO41.3-1.8，MgSO4·7H2O0.4-0.6，玉米浆干粉5-15，酵母粉5-10，柠檬酸钠10-20，氯化铵10-30,硫酸锰0.05-0.2，硫酸亚铁0.015-0.025，NaCl3-8，pH7.1-7.6；更优选可以是如下配方(g/L)：葡萄糖70，果糖8，谷氨酸钠30，氯化钙1.2，K2HPO41.5，MgSO4·7H2O0.5，玉米浆干粉10，酵母粉8，柠檬酸钠15，氯化铵20，硫酸锰0.1，硫酸亚铁0.02，NaCl5，pH7.4。在本专利技术中，优选产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌是在种子培养基中活化培养而获得的。也优选其中，种子培养基可以是如下配方(g/L)：葡萄糖10-30，酵母提取物5-10，蛋白胨5-15，氯化铵2-5，KH2PO41-5，MgSO47H2O0.2-1，氯化钙0.5-1，NaCl3-8，pH7.1-7.6；更优选可以是如下配方(g/L)：葡萄糖20，酵母提取物8，蛋白胨10，氯化铵3，KH2PO43，MgSO47H2O0.5，氯化钙0.8，NaCl5，pH7.4。在本专利技术中，优选发酵或发酵培养是短期的。本专利技术人通过各种方面的研究，在菌株、培养基添加物和发酵步骤等多方面均出人意料地发现了能够提高短期发酵产量的因素。在本专利技术中，优选发酵培养的时间不超过36小时，更优选为26-36小时，如26-28小时或32-36小时等。优选在本专利技术第一或第二方面的方法中，正己烷的添加量为5-50ml/L，优选为8-30ml/L，更优选为10-20ml/L；吐温-80的添加量为0.1-1ml/L，优选为0.2-0.8ml/L，更优选为0.45-0.55ml/L；和/或，甜菜碱的添本文档来自技高网...

【技术保护点】
γ‑聚谷氨酸的发酵方法或者提高γ‑聚谷氨酸发酵产量的方法，其包括：(1)将产γ‑聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌(如，HBY‑PBS‑ZY55)接种入添加了正己烷、吐温‑80和/或甜菜碱的发酵培养基中进行发酵培养；(2)任选在步骤(1)的发酵培养期间进一步添加正己烷；(3)收集发酵培养物中的γ‑聚谷氨酸。

【技术特征摘要】
2014.05.21 CN 20141021332961.γ-聚谷氨酸的发酵方法或者提高γ-聚谷氨酸发酵产量的方法，其包括：
(1)将产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌(如，HBY-PBS-ZY55)接种入添加了正
己烷、吐温-80和/或甜菜碱的发酵培养基中进行发酵培养；
(2)任选在步骤(1)的发酵培养期间进一步添加正己烷；
(3)收集发酵培养物中的γ-聚谷氨酸。
2.权利要求1所述的方法，其中，正己烷的添加量为5-50ml/L，优选为8-30ml/L，
更优选为10-20ml/L；吐温-80的添加量为0.1-1ml/L，优选为0.2-0.8ml/L，更优
选为0.45-0.55ml/L；和/或，甜菜碱的添加量为0.05-0.5g/L，优选为0.1-0.3g/L，
更优选为0.15-0.25g/L。
3.权利要求1所述的方法，其中，发酵培养是短期的，优选发酵培养的时间不
超过36小时，更优选为26-36小时，如26-28小时或32-36小时。
4.权利要求1所述的方法，其中，步骤(1)中的产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌
是在种子培养基中活化培养而获得的。
5.获得高产(优选是短期发酵高产)γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌的方法，其包
括：
(1)将待诱变的产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌液体培养(优选培养至OD600为
10-12)，然后稀释(优选稀释106倍)；
(2)将步骤(1)获得的稀释菌液在黑暗条件下进行紫外照射(优选在30W紫
外灯下30cm处照射180秒)；
(3)将步骤(2)获得的经照射的菌液在平板筛选培养基上避光培养；
(4)将步骤(3)培养获得的单菌落分别进行发酵培养(优选短期发酵)；
(5)测量步骤(4)发酵产生的γ-聚谷氨酸的产量，选择出高产(优选是短期发
酵高产)γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌。
6.权利要求5所述的方法获得的高产(优选是短期发酵高产)γ-聚谷氨酸的枯
草芽孢杆菌，优选其是于2014年5月20日以保藏编号CCTCCNO.M2014213
保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)的枯草芽孢杆菌(BacillusSubtillis)
HBY-PBS-ZY55。
7.权利要求6所述的枯草芽孢杆菌在γ-聚谷氨酸的发酵(优选是短期发酵)中
的应用。
8.权利要求7所述的应用，其中，γ-聚谷氨酸的发酵的方法包括在发酵中维持<...

【专利技术属性】
技术研发人员：周骅，徐佳，陈维，齐宗献，
申请(专利权)人：武汉慧宝康源医学研究有限责任公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42