一种人乳头瘤病毒荧光定量PCR检测试剂盒及其使用方法技术

本发明专利技术提供了一种人乳头瘤病毒荧光定量PCR检测试剂盒，所述检测试剂盒包括PCR反应液，且所述PCR反应液包括PCR缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、用于扩增靶多核苷酸的上下游引物和用于检测靶多核苷酸的探针。本发明专利技术所提供的人乳头瘤病毒荧光定量PCR检测试剂盒具有很好的特异性，且操作快速、方法简便、灵敏度高，同时在反应体系中增加的内标能够有效防止检测呈假阴性。本发明专利技术所提供的人乳头瘤病毒荧光定量PCR检测试剂盒在提取DNA时使用核酸快速释放法，该法简便快速，无需加热。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及医学检测
，更为具体地说，涉及一种人乳头瘤病毒荧光定量PCR检测试剂盒及其使用方法。
技术介绍
人乳头瘤病毒(Humanpapillomavirus，HPV)是一类分子量较小的无包膜的双链环状DNA病毒，专性侵染和寄生人体生殖器官及其它组织器官的上皮细胞。在临床上，根据HPV不同亚型致病力大小或致癌危险性大小不同可将HPV分为高危型和低危型两大类。低危型HPV主要引起肛门皮肤及男性外生殖器、女性大小阴唇、尿道口、阴道下段的外生性疣类病变和低度子宫颈上皮内瘤。高危型HPV除可引起外生殖器疣外，更重要的是引起外生殖器癌、宫颈癌及高度子宫颈上皮内瘤变，其病毒亚型主要有HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68型。HPV在人群中极易传播扩散，可通过直接或间接接触交叉传染，其感染部位隐蔽，发病隐匿，不易早期发现，可致多种增生性病变，在女性生殖系统所引起的最常见的恶性肿瘤为宫颈癌。对宫颈癌的病因学研究可知，高危HPV持续感染是子宫颈癌的主要致病因素，99.7％宫颈癌患者存在HPV感染。临床研究显示，从HPV的持续感染到一般的宫颈癌前病变并最终发展为宫颈癌大约需要8-10年，因此筛查是目前预防和早期诊断宫颈癌的主要手段。美国国立综合癌症网络(NCCN)宫颈癌筛查实践指南等明确指出，即使宫颈细胞学无异常而HPV阳性的30岁以上女性，如其为HPV16、HPV18感染者，应立即进行阴道镜检查。早期宫颈病变的治疗效果远比宫颈癌的治疗效果要好得多，且快速、准确的检测出HPV高危型的感染并同时分型鉴别HPV16、HPV18型对于早期治疗和降低宫颈癌的发病率和死亡率等具有重要的意义。而目前在临床检测高危HPV-DNA的方法中，主要是采用基于实时荧光定量PCR(PolymeraseChainReaction，即聚合酶链式反应)的技术及其改进。实时荧光定量PCR技术是近年来发展迅速的一种核酸检测技术，使用一种带有荧光检测装置的PCR扩增仪，荧光检测装置能够按照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收集检测荧光信号，通过检测荧光信号的动态变化实时反映PCR的每个循环的扩增水平，试验结束后可通过软件自动分析获得扩增曲线，根据扩增曲线与荧光阈值线的交点(即Ct值)以及扩增曲线的形状，可以判断阴阳性结果，并得知样本浓度的定值结果。因此，该技术在靶多核苷酸样品的检测和定量分析中，已逐渐取代传统的PCR方法，得到十分广泛的应用。但是，仅有极少量荧光PCR诊断试剂盒在HPV诊断中使用，且缺乏完善的质控体系，操作比较繁琐，灵敏度不高，检测范围小，因此，还需要进一步完善和提高技术水平，使此类产品更加满足临床准确快速诊断的需要。国内已有多种基于实时荧光定量PCR技术定量检测高危HPV-DNA的方法，这些试剂盒所提供的HPV-DNA提取方法主要是煮沸法，然而煮沸法存在很多不足之处：1)核酸提取过程较复杂，样本处理耗时长，且在处理样本时，经过煮沸裂解、高速离心富集DNA等多个步骤，样本中的DNA存在损耗，尤其对于高浓度的样本，裂解不充分、富集不完全，会造成DNA的大量丢失导致样本定量偏低，同时由于采用了水浴或金属浴的高温加热步骤，容易造成气溶胶污染。2)检测灵敏度不高，约在10000copies/ml左右；3)没有设置阳性内对照(即内标)，无法监控假阴性；4)一般没有预防PCR产物污染的措施。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种人乳头瘤病毒荧光定量PCR检测试剂盒及其使用方法，以解决
技术介绍
所述的现有HPV检测方法灵敏度低的问题。为了解决上述技术问题，本专利技术提供如下技术方案：本专利技术提供了一种人乳头瘤病毒荧光定量PCR检测试剂盒，所述检测试剂盒包括PCR反应液，且所述PCR反应液包括PCR缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、用于扩增靶多核苷酸的上下游引物和用于检测靶多核苷酸的探针；所述用于检测靶多核苷酸的探针具有HPYG1-P1、HPYG1-P2、HPYG1-P3、HPYG2-P、HPYG2-P1、HPYG3-P1、HPYG3-P2、HPYG4-CY5和HPYG5-ROX的序列。优选地，所述用于扩增靶多核苷酸的上下游引物具有HPYG1-F、HPYG1-R1、HPYG1-R2、HPYG2-F、HPYG2-R1、HPYG2-R2、HPYG3-F1、HPYG3-F2、HPYG3-R1、HPYG3-R2、HPYG4-F、HPYG4-R、HPYG5-F、HPYG5-R的序列。优选地，所述检测试剂盒还包括内标，所述内标为β-球蛋白。优选地，所述PCR反应液还包括用于检测内标的探针，所述检测内标的探针具有GB-P的序列。优选地，所述PCR反应液还包括用于扩增内标的上游引物以及下游引物；所述上下游引物具有GB-F、GB-R序列。优选地，所述PCR缓冲液包括pH为7.5的200mmol/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液、30mmol/L的氯化镁溶液、500mmol/L的氯化钾溶液、体积比为0.2％的曲拉通溶液和体积比为10％的甲酰胺溶液。优选地，所述脱氧核糖核苷三磷酸包括dATP、dCTP、dGTP和dUTP。优选地，所述检测试剂盒还包括酶混合液，所述酶混合液为1U/μl～5U/μlTaq酶和0.05U/μl～0.2U/μlUNG酶。优选地，所述检测试剂盒还包括核酸释放剂，所述核酸释放剂包括质量浓度为0.01～0.5mM/L的莎梵婷，质量浓度为50～200mM/L的氯化钾，质量浓度为0.01％～2％十二烷基磺酸钠，体积分数为0.05％～1％的乙醇。优选地，所述检测试剂盒还包括阳性对照，所述阳性对照是浓度为1.00～5.00E+05copies/ml的HPV16型/18型混合强阳性样本。优选地，所述检测试剂盒还包括阴性对照，所述阴性对照为灭菌生理盐水。优选地，所述检测试剂盒还包括定量参考品，所述定量参考品是浓度梯度为1.00～5.00E+07copies/ml、1.00～5.00E+06copies/ml、1.00～5.00E+05copies/ml和1.00～5.00E+04copies/ml的HPV16/18型强阳性质粒。本专利技术还提供了一种人乳头瘤病毒荧光定量PCR检测试剂盒的使用方法，所述使用步骤包括：S01：取体积比为38-44：1-2的PCR反应液和酶混合液，混和均匀并形成PCR-mix，瞬时离心后备用；S02：在PCR反应管中加入2～5μl的核酸释放剂，深吸浅打后本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人乳头瘤病毒荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括PCR反应液，且所述PCR反应液包括PCR缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、用于扩增靶多核苷酸的上下游引物和用于检测靶多核苷酸的探针；所述用于检测靶多核苷酸的探针具有HPYG1‑P1、HPYG1‑P2、HPYG1‑P3、HPYG2‑P、HPYG2‑P1、HPYG3‑P1、HPYG3‑P2、HPYG4‑CY5和HPYG5‑ROX的序列。

【技术特征摘要】
1.一种人乳头瘤病毒荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括
PCR反应液，且所述PCR反应液包括PCR缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、用于扩增靶
多核苷酸的上下游引物和用于检测靶多核苷酸的探针；
所述用于检测靶多核苷酸的探针具有HPYG1-P1、HPYG1-P2、HPYG1-P3、HPYG2-P、
HPYG2-P1、HPYG3-P1、HPYG3-P2、HPYG4-CY5和HPYG5-ROX的序列。
2.根据权利要求1所述的人乳头瘤病毒荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所
述用于扩增靶多核苷酸的上下游引物具有HPYG1-F、HPYG1-R1、HPYG1-R2、HPYG2-F、
HPYG2-R1、HPYG2-R2、HPYG3-F1、HPYG3-F2、HPYG3-R1、HPYG3-R2、HPYG4-F、
HPYG4-R、HPYG5-F和HPYG5-R的序列。
3.根据权利要求2所述的人乳头瘤病毒荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所
述检测试剂盒还包括内标，所述内标为β-球蛋白。
4.据权利要求3所述的人乳头瘤病毒荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述
PCR反应液还包括用于检测内标的探针，所述检测内标的探针具有GB-P的序列。
5.据权利要求4所述的人乳头瘤病毒荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述
PCR反应液还包括用于扩增内标的上游引物以及下游引物；所述上下游引物具有GB-F、
GB-R序列。
6.据权利要求1所述的人乳头瘤病毒荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述
PCR缓冲液包括pH为7.5的200mmol/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液、30mmol/L的氯
化镁溶液、500mmol/L的氯化钾溶液、体积比为0.2％的曲拉通溶液和体积比为10％的甲酰胺
溶液。
7.据权利要求1所述的人乳头瘤病毒荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述
脱氧核糖核苷三磷酸包括dATP、dCTP、dGTP和dUTP。
8.据权利要求1-7中任意一项所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：戴立忠，李勃，刘佳，刘保生，
申请(专利权)人：湖南圣湘生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43