一种ELISA试剂盒抗原间接包被酶标板的包被方法技术

一种ELISA试剂盒抗原间接包被酶标板的包被方法，包括以下步骤：(1)包被；(2)封闭：采用10g/L鱼明胶的0.01mol/LPBS缓冲液封闭；(3)捕获目标抗原；(4)加含5％蔗糖和1～5％牛血清白蛋白的0.01mol/L，pH7.2～7.6磷酸盐缓冲液的固相抗原稳定剂，抽干，即得抗原间接包被酶标板。本发明专利技术包被得到的酶标板保存期可达1年以上，显著提高了抗原间接包被ELISA试剂盒的稳定性与保存期。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种酶标板的包被方法，具体涉及一种ELISA试剂盒抗原间接包被酶标板的包被方法。
技术介绍
抗原间接包被是指首先用某抗原的特异性抗体(单抗或多抗)包被酶标板，然后再通过抗原抗体的特异性结合，捕获目标抗原于酶标板上，用于组装ELISA试剂盒。抗原间接包被制备酶标板的好处在于：一是有助于促进基因工程方法表达的目标抗原蛋白形成其自然构象，通过抗原抗体的特异性亲合反应，进一步纯化了包被抗原，经过洗涤过程使蛋白结构更接近自然构象，从而提高诊断方法的敏感性与特异性；二是经过半纯化和复性的目标抗原蛋白就可以满足要求。目前，国产ELISA试剂盒质量不稳定，主要原因在于直接或间接抗原包被酶标板的稳定性差，导致ELISA试剂盒保存期短；并且市场上的抗原稳定剂，不仅价格昂贵，而且来源不稳定，严重影响了我国ELISA类诊断试剂盒的研制。因此，抗原包被酶标板的包被工艺是保证ELISA试剂盒质量的关键。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是，提供一种稳定性好，保存期长、成本低的ELISA试剂盒抗原间接包被酶标板的包被方法。本专利技术解决其技术问题采用的技术方案是，一种ELISA试剂盒抗原间接包被酶标板的包被方法，包括以下步骤：(1)包被：用0.05mol/LpH9.6碳酸盐缓冲液稀释单克隆抗体或多克隆抗体至工作浓度1～2μg/mL，加入酶标板，每孔加95～105μL，室温下(18～25℃)包被过夜，然后用PBS洗3次；(2)封闭：每孔加含10g/L鱼明胶的0.01mol/LPBS缓冲液95～105μL，35～38℃封闭1～2h，然后用PBS洗涤3次；(3)捕获目标抗原：用0.01mol/LPBS缓冲液稀释目标抗原至工作浓度0.5～1.5μg/mL，每孔95～105μL加入酶标板，18～25℃捕获反应1～1.5h，然后用PBS洗涤3次；(4)加固相抗原稳定剂：在酶标板孔湿润的状况下，每孔加入120～150μL固相抗原稳定剂，室温作用20～40min，弃残液；酶标板置于室温、湿度20％～30％的洁净空间，抽湿机抽干10～12小时，即得抗原间接包被酶标板；其中，所述固相抗原稳定剂为含5％蔗糖和1～5％牛血清白蛋白的0.01mol/L，pH7.0～7.6磷酸盐缓冲液。进一步，步骤(1)中，所述单克隆抗体为口蹄疫病毒3A单克隆抗体，工作浓度为2μg/mL；所述多克隆抗体为口蹄疫病毒2C多克隆抗体，工作浓度为1μg/mL。进一步，步骤(4)中，所述固相抗原稳定剂为含5％蔗糖和1％牛血清白蛋白的0.01mol/L，pH7.5的磷酸盐缓冲液，加入0.1％硫柳汞防腐剂，37℃放置4周制成。本专利技术之ELISA试剂盒抗原间接包被酶标板的包被方法可使间接抗原包被酶标板的保存期达到1年以上，显著提高了ELISA试剂盒的稳定性与保存期；而且所用抗原稳定剂的配方简单，对抗原抗体反应没有干扰，材料易于获得、来源不受限制，适用范围广。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术进一步加以说明。1、材料与方法(1)材料：碳酸盐缓冲液(Na2CO3/NaHCO3)及明胶购自SIGMA公司；口蹄疫病毒非结构蛋白3A与3B单克隆抗体为本实验室制备保存采用常规方法制备；辣根过氧化物酶(HRP)标记3B单克隆抗体委托南京金斯瑞公司标记，滴定工作浓度为1∶5000；口蹄疫病毒非结构蛋白2C表位区多克隆抗体由本实验室采用常规方法制备，采用表达的2C表位区蛋白免疫家兔制备；口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC参考以下文献表达：曹轶梅,刘在新,卢曾军,等.口蹄疫病毒非结构蛋白基因3ABC在大肠杆菌中的表达[J].畜牧兽医学报,2004,35(1):115-118；口蹄疫病毒非结构蛋白2C3AB表达参考以下文献进行：张小丽,田美娜,卢曾军,等.FMDV非结构蛋白2C主要表位区与3AB基因的组合表达与活性分析.生物工程学报,2009,25(1):10-15[J]。(2)非结构蛋白3ABC与2C3AB融合蛋白的表达、纯化及复性参考以下文献进行：曹轶梅,刘在新,卢曾军,等.口蹄疫病毒非结构蛋白基因3ABC在大肠杆菌中的表达[J].畜牧兽医学报,2004,35(1):115-118。曹轶梅,卢曾军,刘在新,等.大肠埃希氏菌表达FMDV3ABC非结构蛋白的纯化复性与活性检测[J].中国兽医科技,2003,33(8):22-25。(3)非结构蛋白3B单克隆抗体的制备与鉴定参考以下文献进行：李永亮,田美娜,卢曾军,等.口蹄疫病毒非结构蛋白3B单克隆抗体的制备和鉴定[J].江苏农业学报,2009,25(2):296-300。实施例1：口蹄疫病毒3A单克隆抗体包被捕获3ABC酶标板的包被方法(1)包被：用包被缓冲液(0.05mol/LpH9.6碳酸盐缓冲液)稀释3A单抗至工作浓度为1：10000，加入酶标板，每孔加100μL，4℃过夜，用PBS洗涤5次。(2)封闭：每孔加封闭液(含1％鱼明胶的PBS溶液)100μL，37℃封闭1h，用PBST洗涤3次。(3)捕获3ABC蛋白：用0.01mol/LPBS缓冲液稀释3ABC蛋白至工作浓度为1μg/mL，每孔100μL加入酶标板，37℃反应1h，PBS洗涤3次。(4)加固相抗原稳定剂：配制含不同浓度蔗糖(50g/L与100g/L)和不同浓度牛血清白蛋白(10、30、50与100g/L)的0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.5)，检测其保护间接包被抗原稳定性的效果。每孔加入120μL，室温作用30min，弃残液；酶标板置室温、湿度20％～30％的洁净空间，抽湿机抽干约12小时。将彻底干燥的酶标板置透明塑封袋中，加干燥剂抽真空密封保存。(5)加待测血清：用含1％BSA的PBST稀释NSP抗体强阳性、弱阳性与阴性对照血清(1∶5稀释)，每孔100μL加入酶标板，室温反应16～20小时，PBST洗涤5遍，拍干。(6)加酶标3B单抗：用血清稀释液将酶标3B单抗稀释至最适工作浓度，每孔100μL加入酶标板，室温反应1h，PBST洗涤5遍，拍干。(7)加底物显色：每孔100μL加入TMB底物溶液，37℃避光反应10～15min。(8)终止：每孔加入0.3mol/LH2SO4使反应终止。测定OD值：用酶标仪测定450nm波长OD值。计算阳性对照与弱阳性本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种ELISA试剂盒抗原间接包被酶标板的包被方法，其特征在于，(1)包被：用0.05mol/L pH 9.6碳酸盐缓冲液稀释单克隆抗体或多克隆抗体至工作浓度1～2μg/mL，加入酶标板，每孔加95～105μL，室温下包被过夜，然后用PBS洗3次；(2)封闭：每孔加含10g/L鱼明胶的0.01mol/L PBS缓冲液95～105μL，35～38℃封闭1～2h，然后用PBS洗涤3次；(3)捕获目标抗原：用0.01mol/L PBS缓冲液稀释目标抗原至工作浓度0.5～1.5μg/mL，每孔95～105μL加入酶标板，18～25℃捕获反应1～1.5h，然后用PBS洗涤3次；(4)加固相抗原稳定剂：在酶标板孔湿润的状况下，每孔加入120～150μL固相抗原稳定剂，室温作用20～40min，弃残液；酶标板置于室温、湿度20％～30％的洁净空间，抽湿机抽干10～12小时，即得抗原间接包被酶标板；其中，所述固相抗原稳定剂为含5％蔗糖和1～5％牛血清白蛋白的0.01mol/L，pH 7.2～7.6磷酸盐缓冲液。

【技术特征摘要】
1.一种ELISA试剂盒抗原间接包被酶标板的包被方法，其特征在于，
(1)包被：用0.05mol/LpH9.6碳酸盐缓冲液稀释单克隆抗体或
多克隆抗体至工作浓度1～2μg/mL，加入酶标板，每孔加95～105
μL，室温下包被过夜，然后用PBS洗3次；
(2)封闭：每孔加含10g/L鱼明胶的0.01mol/LPBS缓冲液95～
105μL，35～38℃封闭1～2h，然后用PBS洗涤3次；
(3)捕获目标抗原：用0.01mol/LPBS缓冲液稀释目标抗原至工作
浓度0.5～1.5μg/mL，每孔95～105μL加入酶标板，18～25℃捕获
反应1～1.5h，然后用PBS洗涤3次；
(4)加固相抗原稳定剂：在酶标板孔湿润的状况下，每孔加入120～
150μL固相抗原稳定剂，室温作用20～40min，弃残液...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢曾军，付元芳，曹轶梅，孙普，白兴文，李平花，包慧芳，李冬，陈应理，刘在新，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃;62