连接酶-辅助的核酸环化和扩增制造技术

本文提供在单一反应容器中从线性DNA生成和扩增单链DNA环，而无需任何插入的纯化步骤的方法。单链DNA环经由模板-非依赖性单链DNA连接而形成。本文提供从血液提取的循环核酸的全基因组扩增。本文还提供用于进行所公开的方法的试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利
本专利技术主要涉及包括经由模板-非依赖性单链DNA连接，从单链或双链线性DNA生成单链DNA环的核酸测定法。本专利技术还涉及单链DNA环经由滚环扩增的扩增和/或检测。单链DNA环的生成和后续的DNA扩增在单一反应容器中进行，而无需任何插入的分离和/或纯化步骤。还提供用于进行该方法的试剂盒。背景DNA扩增是一个复制目标双链DNA(dsDNA)以生成其多个拷贝的过程。因为dsDNA的各条链是反平行的和互补的，每条链可用作其互补链产生的模板链。模板链作为整体或作为截短的部分保留，而互补链通过DNA聚合酶从脱氧核苷三磷酸(dNTP)装配。互补链合成从杂交至模板链的引物序列的3＇末端开始，以5＇→3＇方向进行。全基因组扩增(WGA)包括目标DNA的非-特异性扩增。WGA往往通过多重置换扩增(MDA)技术，采用在目标DNA的多个位置引发DNA合成的随机寡核苷酸引物连同具有链置换活性的高保真性DNA聚合酶(如，Phi29聚合酶)一起实现。尽管目前可市售获得的WGA系统例如GenomiPhi(GEHealthcare,USA)和RepliG(Qiagen)试剂盒提供具有高分子量目标DNA的最佳结果，但当目标DNA短和/或高度片段化时，这些系统的性能是差的。当目标DNA被片段化和序列长度少于约1000个核苷酸时，使用常规方法扩增目标DNA导致扩增速度降低，显著的序列丢失(特别是在接近目标DNA的末端)，和高度的序列-偏倚扩增。随着模板DNA的长度减少，在MDA反应中引导该链的可能性成倍地减少。这降低了这些较短片段的扩增潜力。因此，用于非-特异性地扩增短的、片段化DNA的有效方法是高度合乎需要的。连接-介导的聚合酶链反应(PCR)已被用来扩增片段化dsDNA。然而，在这些反应中，只有小部分的片段化DNA得到扩增，导致基因组覆盖不足。为有效地扩增片段化的目标dsDNA，可首先修复它们，然后通过钝端连接被串联化，以生成长于1000个碱基对(bp)的序列。然而，往往需要相对较高浓度的目标DNA以促进串联化(concatamerization)和后续的扩增。双链目标DNA的环化也被用于各种基于核酸的测定法，包括MDA、WGA、超支化滚环扩增(RCA)和大规模平行DNA测序。为了有效地环化和扩增片段化dsDNA，片段化DNA的双链末端被首先修复，接着经钝端连接，以形成双链DNA环。然而，环化长度少于500bp的双链DNA片段是困难的。双链DNA可被变性以产生单链DNA(ssDNA)，其可在模板-依赖性分子内连接反应中使用连接酶而被进一步环化。然而，需要目标DNA的现有序列信息，以进行模板-依赖性环化。ssDNA的模板-非依赖性分子内连接也已有文献记载。例如，TS2126RNA连接酶(可以商标名ThermoPhageTMRNA连接酶II或ThermoPhageTMssDNA连接酶(Prokaria,Matis,Iceland)或CircLigaseTMssDNA连接酶(EpicenterBiotechnologies,Wisconsin,USA)经市售获得)已被用于制备数字(digital)DNA球，和/或DNA，例如基因组DNA的位点-特异性裂解和扩增。从mRNA的5＇-端片段制备的线性单链互补DNA(cDNA)分子在使用TS2126RNA连接酶环化后，也已通过滚环复制扩增。通过适当地将有义RNA聚合酶启动子序列掺入cDNA中，已显示环化的cDNA模板作为转录底物起作用，并因而进行在生物学样本中的mRNA分子的扩增。此外，TS2126RNA连接酶已被用来扩增用于随机扩增cDNA末端(RACE)的cDNA末端。通过采用TS2126RNA连接酶，还从有限量的片段化DNA，生成用于滚环扩增的DNA模板。该方法包括使线性的片段化dsDNA变性以获得线性ssDNA片段，用CircLigaseTMssDNA连接酶连接线性ssDNA以获得单链DNA环，然后使用随机引物和Phi29DNA聚合酶经由RCA扩增单链DNA环。然而，即使在优化反应条件后，生成的单链环状DNA的量是高度可变和序列依赖性的。例如，在相同的连接条件下，包含5＇G和3＇T核苷酸的寡核苷酸比其包含5＇A和3＇C的互补寡核苷酸显著更好地连接。此外，分子内连接效率在具有相同的或极其类似大小的线性ssDNA序列中变化，但在核苷酸序列中有小的差异。效率在不同大小的线性ssDNA序列(如，序列长度范围从100个碱基至数千碱基大小)中也有变化。而且，连接-扩增反应的所有尝试涉及中间分离、纯化和/或清洁步骤，因而使得连接-扩增工作流程繁琐。例如，通过环化，接着滚环扩增的片段化DNA的法医样本的分析以多步骤进行，包括5＇DNA磷酸化、接头连接、DNA环化和全基因组扩增。每个步骤反应在进行下一步骤之前要经受反应清理。当连接和扩增在单一反应容器中进行时，未观察到扩增优点。然而，多步骤过程往往造成模板DNA的丢失并导致分析失败。用于在单一反应容器中非-特异性地扩增短的DNA序列，而无任何序列偏倚和任何插入的清洁步骤的有效方法因而是高度需要的。简述在一些实施方案中，提供一种从线性DNA生成单链DNA环的方法。该方法包括提供线性DNA，通过在磷酸供体的存在下使其与多核苷酸激酶一起孵育将线性DNA末端修复以生成具有在5′末端的磷酸基团和在3′末端的羟基的可连接的DNA序列，和用连接酶对经修复的可连接的DNA序列进行分子内连接以生成单链DNA环的步骤。该方法的所有步骤在单一反应容器中进行，而无需任何插入的分离或纯化步骤。磷酸供体可以是鸟苷三磷酸(GTP)、胞苷三磷酸(CTP)、尿苷三磷酸(UTP)、脱氧胸苷三磷酸(dTTP)或其组合。线性DNA可以是双链或者单链DNA。DNA可以是片段化DNA例如循环DNA。可连接的DNA，如果呈现为双链形式，则在分子内连接反应之前需要被变性。能够模板-非依赖性的、分子内连接单链DNA序列的预腺苷酸化连接酶可被用于连接反应。在一些实施方案中，提供一种从线性DNA生成单链DNA环的方法，其中该方法在分子内连接步骤之前采用DNA预腺苷酸化步骤。线性DNA可在腺苷三磷酸(ATP)的存在下，任选地用多核苷酸激酶孵育，以生成包含在5′末端的磷酸基团和在3′末端的羟基的可连接的DNA序列。如果线性DNA呈现为高度片段化形式，可优先从线性DNA生成可连接的DNA序列。线性DNA或可连接的DNA序列然后在ATP的存在下用腺苷酸化酶孵育，以生成5＇腺苷酸化DNA序列。5＇腺苷酸化DNA序列然后用非-腺苷酸化连接酶孵育，该酶能够进行模板-非依赖性分子内连接5＇腺苷酸化DNA序列，以生成单链DNA环。该方法的所有步骤在单一反应容器中进行，而无需任何插入的分离或纯化步骤。如果非-腺苷酸化连接酶是ATP-依赖性连接酶，在分子内连接反应前，ATP可必须从反应混合物中除去(如，通过用磷酸酶处理反应混合物)。如果5＇腺苷酸化DNA呈现为双链形式，则在分子内连接反应前需要变性。附图本专利技术的这些和其它特征、方面和优点，当参照附图阅读以下详细描述时，将变得更易理解。图1说明片段化dsDNA的连接酶-辅助全基因组扩增的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从线性DNA生成单链DNA环的方法，所述方法包括：(a) 提供线性DNA；(b) 在磷酸供体的存在下，用多核苷酸激酶孵育线性DNA，以生成具有在5´末端的磷酸基团和在3´末端的羟基的可连接的DNA序列；和(c) 用能够进行模板‑非依赖性的、分子内连接单链DNA序列的连接酶孵育所述可连接的DNA序列，以生成单链DNA环，其中该方法的所有步骤在单一反应容器中进行，而无需任何插入的分离或纯化步骤。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.07.26 US 13/9520401.一种从线性DNA生成单链DNA环的方法，所述方法包括：
(a)提供线性DNA；
(b)在磷酸供体的存在下，用多核苷酸激酶孵育线性DNA，以生成具有在5′末端的磷酸基团和在3′末端的羟基的可连接的DNA序列；和
(c)用能够进行模板-非依赖性的、分子内连接单链DNA序列的连接酶孵育所述可连接的DNA序列，以生成单链DNA环，
其中该方法的所有步骤在单一反应容器中进行，而无需任何插入的分离或纯化步骤。
2.权利要求1的方法，其中步骤(b)使用除了腺苷三磷酸或脱氧腺苷三磷酸的磷酸供体进行。
3.权利要求2的方法，其中磷酸供体选自鸟苷三磷酸、胞苷三磷酸、尿苷三磷酸、脱氧胸苷三磷酸及其组合。
4.权利要求3的方法，其中磷酸供体是鸟苷三磷酸。
5.权利要求4的方法，其中线性DNA在少于200μM的鸟苷三磷酸的存在下用多核苷酸激酶孵育。
6.权利要求5的方法，其中线性DNA在至多30μM的鸟苷三磷酸和至多2.5mM的锰离子的存在下用多核苷酸激酶孵育。
7.权利要求4的方法，其还包括如果可连接的DNA序列呈现为双链形式，则在步骤(c)之前使可连接的DNA序列变性。
8.权利要求7的方法，其中所述连接酶是预腺苷酸化连接酶。
9.权利要求8的方法，其中所述预腺苷酸化连接酶是预腺苷酸化TS2126RNA连接酶。
10.权利要求9的方法，其中步骤(a)-(c)以连续的方式在单一反应容器中进行。
11.权利要求10的方法，其中所述方法的所有步骤在腺苷三磷酸或脱氧腺苷三磷酸的不存在下进行。
12.权利要求11的方法，其中所述方法的所有步骤在HEPES缓冲液中进行。
13.权利要求1的方法，其中所述线性DNA是循环DNA、从福尔马林固定的石蜡包埋的样本分离的DNA、已暴露于环境条件的法医DNA样本或古老的DNA样本。
14.权利要求1的方法，其还包括在等温条件下扩增单链DNA环。
15.权利要求14的方法，其中单链DNA环经由滚环扩增来扩增。
16.权利要求15的方法，其中所述滚环扩增使用耐核酸酶引物进行。
17.权利要求16的方法，其中所述耐核酸酶引物包含至少一个修饰的核苷酸。
18.权利要求15的方法，其中单链DNA环使用随机引物混合物扩增。
19.权利要求15的方法，其中单链DNA环使用基本上由部分约束的引物混合物组成的引物溶液扩增，所述引物混合物包含末端错配引物-二聚体结构。
20.一种从线性DNA生...

【专利技术属性】
技术研发人员：RC赫勒，JR奈尔逊，EL克瓦姆，
申请(专利权)人：通用电气公司，
类型：发明
国别省市：美国;US