一种利用多重PCR技术进行SNP-单体型分析的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用多重PCR技术进行SNP-单体型分析的方法，设计的引物在合成时合并为一管进行单引物扩增，同时利用MALBAC技术完成全基因组扩增，在多重PCR扩增时采用touch down PCR扩增程序，并且结合高通量测序以及合理的数据分析，只需一套SNP检测，无需因对象不同而设计不同的方案，缩短工作周期，降低成本。此外，本发明专利技术所提供的方法对于家系和胚胎基因组SNP信息进行捕获，能有效、准确的确定胚胎SNP信息，并进行SNP-单体型分析，确定胚胎是否携带遗传基因的突变位点，有效地克服了现有技术成本高、周期长、应用范围小的诸多缺陷。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学与生物信息学领域，具体涉及一种利用多重PCR技术进行SNP-单体型分析的方法。
技术介绍
2014年世界卫生组织统计，出生缺陷大约在33个婴儿中影响1人，每年造成约320万例与出生缺陷相关的残疾，每年估计有27万新生儿死于出生缺陷。出生缺陷可源自遗传、传染或环境方面的因素，许多出生缺陷是可以预防的，例如单基因遗传病，做好充分的孕前和产前筛查是关键。胚胎植入前诊断(PGD)技术是指在体外受精过程中，对具有遗传风险患者的胚胎进行植入前活检和遗传学分析，以选择无遗传学疾病的胚胎植入宫腔，从而获得正常胎儿的诊断方法，可从根源上阻断单基因遗传病的发生和传递，将出生缺陷的预防提前到胚胎阶段。然而，单基因遗传病的PGD检测并未广泛应用，其原因主要是由于标本量少(仅几个细胞)，容易产生等位基因脱扣(ADO)和污染，检测较为困难，现有技术无法完全满足PGD检测要求。胚胎植入前单体型分析是目前PGD检测技术的主要方法。该方法通过检测突变位点和多个与其连锁的短串联重复序列(STR)或单核苷酸多态性(SNP)来确定突变连锁单体型，降低了等位基因扩增不平衡、ADO及污染的影响。其中，多重荧光PCR技术结合多个STR进行突变位点的单体型分析曾成为PGD检测连锁分析的主要技术方案，但是，STR连锁标记较少，应用到具体案例中可能会没有可用STR位点，所以进行临床检测前需要做大量预实验工作。而且，STR遗传标记大多距离致病位点较远，可能会由于染色体重组导致误诊。相反，SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500-1000个碱基对(bp)中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多，且SNP不会发生STR中存在的多个核心序列重复、核心序列的非整倍重复等现象，此外，SNP检测对DNA样本的要求更低、价格更加廉价。因此，这种具备密度高、数量多、稳定性高并且高通量等特征的SNP标记，逐渐取代STR作为连锁分析标记的首选。目前，检测遗传标记分型技术应用广泛的主要有多重荧光PCR(MF-PCR)、DNA芯片技术(SNP-array)、利用探针捕获SNP(国际公布号WO2015/042980)等，从一定程度上促进了SNP-单体型分析的发展。然而，上述各技术均存在一定的缺陷，例如多重荧光PCR技术采用多重PCR结合荧光探针检测STR分型，由于STR标记较少，距离较远易重组，实践中可用STR位点较少，检测成本较高，故此技术无法进行批量检测；而芯片和探针捕获SNP的方法，与普通PCR捕获SNP方法相比较，成本偏高，周期偏长。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题就是要克服现有技术中所存在的上述不足，提供一种利用多重PCR技术进行SNP-单体型分析的方法，其操作简单、结果准确，能够缩短检测周期、降低成本。本专利技术的目的通过以下技术方案实现：本专利技术提供了一种利用多重PCR技术进行SNP-单体型分析的方法，具体步骤如下所述。1.根据目标区域设计引物1.1确定目标基因，根据具体种属，以NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation)官方网站基因序列为参考序列确定目标基因所在染色体的具体位置，从而锁定捕获区域。1.2多重PCR-SNP设计1.2.1选择SNP区域，界定在目的基因上下游1M范围内，杂合度较高(千份个体数据库中频率大于0.3)；SNP间距越小，重组率越小。1.2.2SNP区域捕获范围，在SNP位点上下游100bp，捕获片段大小为200bp左右。1.2.3引物设计：利用Oligo、Primer等引物设计软件或引物专业设计网站进行引物设计，设计时尽量将各SNP位点引物的退火温度控制在较小范围内(如50-55℃、53-58℃、55-60℃或50-60℃等范围)，利于后面的PCR扩增，引物长度则控制在20-25bp左右。1.2.4引物评估：引物设计完成后采用NCBI或UCSC等专业网站进行引物特异性评估(如错配率、发夹结构等等)，评估合格后进行引物合成，设计的所有引物在合成时等摩尔比例合并为一管，利用后面扩增单管操作。2.家系样本及胚胎样本准备2.1提取家系中患病个体、患病个体的父本以及母本的外周血样本，获得基因组DNA。2.2采集胚胎细胞样本，利用MALBAC技术完成胚胎细胞的全基因组扩增；其中，胚胎细胞可以选自人或者其他哺乳动物。3.多重PCR扩增，对家系及胚胎样本进行目标区域SNP的捕获。将步骤1中设计的所有引物在合成时等摩尔比例合并为一管，作为单引物扩增，一管操作，同时扩增几十甚至上百个SNP位点。采用touchdownPCR扩增程序，覆盖多对引物退火温度，提高扩增效率，最终可以达到90％的覆盖度。对于多重PCR扩增的前期阶段，需进行预实验，主要通过以下几个方面进行优化：a)根据设计所得引物退火温度，设置不同范围的touchdownPCR，以提高扩增效率。例如，某目的区域SNP位点引物退火温度大致范围在60-55℃，则可以先以每个循环降1℃，设置60-55℃的退火温度范围。如果扩增后电泳条带显示有非特异带，或经步骤b)中qPCR验证扩增效率不佳，此种情况下，可以选择每个循环降0.5℃，设置60-55℃；或者每个循环降1℃，设置60-50℃；b)对多重扩增产物进行qPCR验证，检测多重扩增中各个SNP位点引物的扩增效率，对于反复验证扩增效率较低的引物进行替换；c)设置不同梯度的模板量(例如50微升体系中，选择40、60、80、100、120、150ng的模板梯度)进行扩增，找出扩增效率高的最低模板量，实现低模板量的多个SNP扩增；d)基于普通PCR扩增，进行扩增体系优化，提高扩增效率。例如，扩增时，不用普通DNA聚合酶，而采用热启动DNA聚合酶或高保真DNA聚合酶；dNTP和Mg2+相对比例优化；对于GC含量较高的区域，加入某些增强剂等等。预实验成功后，进行家系及胚胎样本的扩增。对扩增产物进行纯化、建库、上机测序，根据测序数据分析结果，进行SNP-单体型分析。4.高通量测序采用高通量测序平台，对样本进行测序。测序平台不受特别限制，第二代测序平台：包括但不限于Illumina公司的GA、GAII、GAIIx、HiSeq1000/2000/2500/3000/4000、XTen、XFive、NextSeq500/550、MiSeq，AppliedBiosystems的SOLiD，Roche的454本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用多重PCR技术进行SNP‑单体型分析的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)根据目标区域设计引物(1.1)确定目标基因，根据具体种属，以NCBI官方网站基因序列为参考基因确定目标基因所在染色体的具体位置，从而锁定捕获区域；(1.2)选择SNP区域，界定在目标基因上下游1M范围内，进一步确定SNP区域捕获范围，在SNP位点上下游100bp捕获片段大小为200bp左右，利用引物设计软件或引物专业设计网站进行引物设计，引物设计完成后对引物进行特异性评估，评估合格后进行引物合成；(2)家系样本及胚胎样本的准备(2.1)提取家系中患病个体、父本、母本的外周血样本，获得基因组DNA；(2.2)采集胚胎细胞样本，进行全基因组扩增；(3)多重PCR扩增，对家系及胚胎样本进行目标区域SNP的捕获；(4)采用高通量测序平台，对样本进行测序；(5)数据分析(5.1)将步骤(4)获得的测序结果去掉接头以及低质量数据，采用比对软件比对到参考基因组；(5.2)用软件获得目标区域的SNP，所述软件包括但不限于samtools mpileup，GATK，FreeBayes，VarScan中的至少一种；(5.3)SNP过滤：测序深度最低为100×，等位基因杂合度差异最低为10％，除去潜在错误的SNP；(5.4)筛选区分型SNP，并构建父本和母本SNP‑单体型：同一SNP位点，在父本和母本的4个等位基因碱基中，有1个碱基不同于其他3个即可区分；(5.5)分析SNP‑单体型：胚胎SNP‑单体型有2个，分别遗传自父本和母本各1条，根据区分型SNP和孟德尔遗传原理，判断其SNP‑单体型具体哪个是父源遗传，哪个是母源遗传；(5.6)结果分析：根据步骤(5.4)确定父本和母本SNP‑单体型，区分出与致病位点连锁的单体型，将胚胎所在SNP的具体等位基因对比，根据孟德尔遗传原理，判断胚胎是否携带致病基因位点。...

【技术特征摘要】
1.一种利用多重PCR技术进行SNP-单体型分析的方法，其特征在于，包括如下
步骤：
(1)根据目标区域设计引物
(1.1)确定目标基因，根据具体种属，以NCBI官方网站基因序列为参考基因
确定目标基因所在染色体的具体位置，从而锁定捕获区域；
(1.2)选择SNP区域，界定在目标基因上下游1M范围内，进一步确定SNP区
域捕获范围，在SNP位点上下游100bp捕获片段大小为200bp左右，利用引物
设计软件或引物专业设计网站进行引物设计，引物设计完成后对引物进行特异性
评估，评估合格后进行引物合成；
(2)家系样本及胚胎样本的准备
(2.1)提取家系中患病个体、父本、母本的外周血样本，获得基因组DNA；
(2.2)采集胚胎细胞样本，进行全基因组扩增；
(3)多重PCR扩增，对家系及胚胎样本进行目标区域SNP的捕获；
(4)采用高通量测序平台，对样本进行测序；
(5)数据分析
(5.1)将步骤(4)获得的测序结果去掉接头以及低质量数据，采用比对软件比
对到参考基因组；
(5.2)用软件获得目标区域的SNP，所述软件包括但不限于samtoolsmpileup，
GATK，FreeBayes，VarScan中的至少一种；
(5.3)SNP过滤：测序深度最低为100×，等位基因杂合度差异最低为10％，
除去潜在错误的SNP；
(5.4)筛选区分型SNP，并构建父本和母本SNP-单体型：同一SNP位点，在父
本和母本的4个等位基因碱基中，有1个碱基不同于其他3个即可区分；
(5.5)分析SNP-单体型：胚胎SNP-单体型有2个，分别遗传自父本和母本各1
条，根据区分型SNP和孟德尔遗传原理，判断其SNP-单体型...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆思嘉，张凤环，任军，
申请(专利权)人：上海序康医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31