一种H7N9禽流感病毒检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种H7N9禽流感病毒检测试剂盒，其包括：第一反应液，其具有缓冲液、0.1mol/L的NaCl、修饰有第一单链DNA的第一纳米金，所述第一单链DNA具有等量且分别与H7特征基因序列互补的第一上游DNA和第一下游DNA；第二反应液，其具有缓冲液、0.1mol/L的NaCl、修饰有第二单链DNA的第二纳米金，所述第二单链DNA具有等量且分别与N9特征基因序列互补的第二上游DNA和第二下游DNA。本发明专利技术其仅需配合使用紫外分光光度计，即能快速、高效的检测出H7N9禽流感病毒，利于对禽流感病毒H7N9亚型及时作出早期诊断、反应和治疗。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种H7N9禽流感病毒检测试剂盒。更具体地说，本专利技术涉及一种基于纳米金的H7N9禽流感病毒检测试剂盒。
技术介绍
H7N9型禽流感是一种新型禽流感，是甲型流感病毒的一种，属于高致病性禽流感病毒。该病毒于2013年3月底在上海和安徽两地率先发现，截至2015年01月25日，全国已确诊133人，37人死亡，76人痊愈。由于该型禽流感病毒具有高致病性、高死亡率的特点，如何快速有效的检测、筛查出人是否感染，对病毒的防控具有重要的意义。目前，H7N9禽流感病毒主要通过核酸检测来进行，该方法直接检测病原体核酸，具有高敏感，高特异和短检测窗口期等优点，为疫病早诊断、早治疗、降低病死率以及控制疫情争取时间。根据所用设备的不同，实时荧光定量PCR仪进行的RT-PCR可用于定量检测，普通PCR基因扩增仪可用于定性检测，另外还有依据H7N9人感染禽流感的核酸特定序列研制的基于引物和探针的PCR检测试剂盒。但上述检测方法均需要专门配备PCR基因扩增仪，检测成本较高，检测时间较长。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。本专利技术还有一个目的是提供一种H7N9禽流感病毒检测试剂盒，其仅需配合使用紫外分光光度计，即能快速、高效的检测出H7N9禽流感病毒，利于对禽流感病毒H7N9亚型及时作出早期诊断、反应和治疗。为了实现根据本专利技术的这些目的和其它优点，提供了一种H7N9禽流感病毒检测试剂盒，其用于检测禽流感病毒中的H7亚型和N9亚型，该试剂盒包括：第一反应液，其用于检测H7亚型，其具有0.1mol/L的pH为7.3缓冲液、0.1mol/L的NaCl和修饰有第一单链DNA的第一纳米金，所述第一单链DNA具有摩尔比为1:1的第一上游DNA和第一下游DNA，其中所述第一上游DNA和第一下游DNA不互补，并分别与所述H7亚型中的特征基因序列互补；第二反应液，其用于检测N9亚型，其具有0.1mol/L的pH为7.3缓冲液、0.1mol/L的NaCl和修饰有第二单链DNA的第二纳米金，所述第二单链DNA具有摩尔比为1:1的第二上游DNA和第二下游DNA，其中所述第二上游DNA和第二下游DNA不互补，并分别与所述N9亚型中的特征基因序列互补；其中，所述第一纳米金和第二纳米金的粒径范围均在10～50nm内。在检测前，首先对待检样品进行核酸提取，然后在两份提取液分别加入所述第一反应液和第二反应液，对H7和N9亚型分别进行检测。当第一反应液加入上述提取液时，纳米金上修饰的与H7亚型中的特征基因序列互补的单链DNA能够迅速结合到目标核酸上，引起纳米金粒子聚集，从而导致纳米金本身紫外光谱的改变，出现新的吸收峰，同时该吸收峰的强度与目标核酸的浓度成正比，该变化能够通过紫外分光光度计灵敏的检测出来，从而定性甚至定量H7亚型的含量。同理，当第二反应液加入上述提取液时，通过DNA分子的互补杂交也会引起纳米金的聚集，使溶液颜色发生变化，从而定性甚至定量N9亚型的含量。综合第一反应液液与第二反应液中的检测结果，只有在两份待检样品提取液中同时检测到信号时，才能确认H7N9禽流感病毒的存在。优选的是，其中，所述第一纳米金和第二纳米金的粒径相差5～15nm，纳米金的尺寸不同，纳米金聚集后产生的紫外信号也不同，在分别检测N7和H9的反应液中，使用不同尺寸的纳米金，根据紫外信号的不同可直接对N7亚型和H9亚型进行区分，进一步提高了检测结果的可辨识性和直观性。优选的是，其中，所述第一单链DNA和第二单链DNA的浓度均为0.1～10nmol/L，纳米金表面修饰的单链DNA的浓度对杂交效率有较大影响，单链DNA的浓度过低会降低单链DNA中在纳米金表面的修饰效果，减低杂交效率，但单链DNA的浓度也不能过高，否则较高的空间位阻也会降低杂交效率。优选的是，其中，所述第一单链DNA通过巯基修饰于第一纳米金，所述第二单链DNA通过巯基修饰于第二纳米金。优选的是，其中，所述第一纳米金与第一单链DNA之间还具有3～6个第一保护碱基，所述第二纳米金与第二单链DNA之间还具有3～6个第二保护碱基，防止由于空间位阻而妨碍单链DNA与H7、N9之间的配对杂交，提高检测的准确性。优选的是，其中，所述第一纳米金分别结合在第一上游DNA的5’端和第一下游DNA的3’端，以保证当第一上游DNA和第一下游DNA与H7亚型中的特征基因序列互补配对时，纳米金分别位于杂交核酸序列的两端，同理，第二纳米金分别结合在第二上游DNA的5’端和第二下游DNA的3’端。优选的是，其中，所述缓冲液选自Tris-HCl、BPS和HEPES中的任意一种。本专利技术至少包括以下有益效果：(1)本专利技术具有很高的灵敏度，不需要进行PCR扩增，能够直接在核酸提取液中进行检测，操作简单，筛查速度快，大量节约检测的时间，能够大范围进行H7N9禽流感病毒的筛查；(2)本专利技术仅需设备紫外分光光度计即可实现H7N9禽流感病毒的快速检测，检测费用低；(3)本专利技术检测技术难度低，便于推广，对H7N9禽流感的早期诊断和防控具有重要的意义。本专利技术的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本专利技术的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。附图说明图1为本专利技术的一个实施例中H7N9禽流感病毒检测的原理图。图中：1、纳米金，2、纳米金上修饰的单链DNA，3、靶基因序列。具体实施方式下面结合附图对本专利技术做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。图1示出了根据本专利技术的一种实现形式，本专利技术试剂盒任一反应液中的纳米金为两种单链DNA修饰后的等量混合物，这两种单链DNA分别为靶基因互补序列的一半，通过单链DNA末端的巯基与纳米金结合，当向反应液中加入靶基因进行杂交后，两种单链DNA分别按照特定顺序与靶基因结合，纳米金离子聚集，溶液颜色发生变化，用以靶基因的定性或定量。在本专利技术的另一实例中：(1)试剂盒第一反应液与第二反应液的配制：第一反应液含有pH值为7.3的0.1mol/LTris-HCl缓冲液，含有0.1mol/LNaCl，第一纳米金粒径大小为15nm，通过DNA末端的巯基，分别修饰上第一上游DNA5’本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种H7N9禽流感病毒检测试剂盒，其用于检测禽流感病毒中的H7亚型和N9亚型，其特征在于，包括：第一反应液，其具有0.1mol/L的pH为7.3缓冲液、0.1mol/L的NaCl和修饰有第一单链DNA的第一纳米金，所述第一单链DNA具有摩尔比为1:1的第一上游DNA和第一下游DNA，其中所述第一上游DNA和第一下游DNA不互补，并分别与所述H7亚型中的特征基因序列互补；第二反应液，其具有0.1mol/L的pH为7.3缓冲液、0.1mol/L的NaCl和修饰有第二单链DNA的第二纳米金，所述第二单链DNA具有摩尔比为1:1的第二上游DNA和第二下游DNA，其中所述第二上游DNA和第二下游DNA不互补，并分别与所述N9亚型中的特征基因序列互补；其中，所述第一纳米金和第二纳米金的粒径范围均在10～50nm内。

【技术特征摘要】
1.一种H7N9禽流感病毒检测试剂盒，其用于检测禽流感病毒中的H7
亚型和N9亚型，其特征在于，包括：
第一反应液，其具有0.1mol/L的pH为7.3缓冲液、0.1mol/L的NaCl和
修饰有第一单链DNA的第一纳米金，所述第一单链DNA具有摩尔比为1:1
的第一上游DNA和第一下游DNA，其中所述第一上游DNA和第一下游DNA
不互补，并分别与所述H7亚型中的特征基因序列互补；
第二反应液，其具有0.1mol/L的pH为7.3缓冲液、0.1mol/L的NaCl和
修饰有第二单链DNA的第二纳米金，所述第二单链DNA具有摩尔比为1:1
的第二上游DNA和第二下游DNA，其中所述第二上游DNA和第二下游DNA
不互补，并分别与所述N9亚型中的特征基因序列互补；
其中，所述第一纳米金和第二纳米金的粒径范围均在10～50nm内。
2.如权利要求1所述的H7N9禽流感病毒检测试剂盒，其特征在于，所
述第一纳米金和第二纳米金的粒径相差5～1...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈名利，尹焕才，殷建，白鹏利，
申请(专利权)人：中国科学院苏州生物医学工程技术研究所，
类型：发明
国别省市：江苏;32