一种检测铅的生物传感器及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种检测铅的生物传感器及检测方法，通过石英晶体微天平(QCM)金电极表面自组装巯基修饰的功能核酸与带巯基的寡核苷酸修饰的纳米金构建铅离子的检测体系。基于QCM电极的频率信号变化与铅离子浓度成反比，则通过确定电极的频率信号实现铅离子的定量检测。本发明专利技术提供的生物传感器及检测方法，操作简单、成本低廉、检测灵敏度高、特异性强，可以实现对铅离子的高效检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种用于检测铅的生物传感器及检测方法，属于生物传感器

技术介绍
铅是一种最为常见的重金属元素之一，具有较强毒性，对环境与人类造成的危害已引起全球的广泛关注。环境中的铅具有持久性和高度的生物富集性，对其产生经久不衰的污染。进入人体中的铅，对人类健康产生极大的危害。当人体内铅含量超过一定水平时，会对免疫系统和神经系统造成严重危害，特别是婴幼儿。婴幼儿体内铅含量超标时，影响其智力与生长发育，并损伤其认知能力、神经行为和学习记忆等脑功能，严重者造成痴呆。因此，建立高灵敏度、高选择性的铅离子检测方法具有重要的现实意义。传统的铅检测方法:原子吸收光谱、双硫腙比色、原子发射光谱、电感耦合等离子体质谱、原子荧光光谱和气相色谱法等，这些方法虽准确可靠，但在实际应用中需要昂贵复杂的仪器设备以及专业技术人员，费力费时，难以满足大规模应用及实时原位检测的需要。所以研究出一种快速、简便、低成本、高灵敏度的铅离子检测手段具有十分重要的意义。现今，新型的铅离子检测技术有化学传感器和生物传感器技术，其中功能核酸类生物传感器具有选择性好、信号转换容易等特点而渐成焦点。用于检测铅的一类功能核酸为富含鸟嘌呤(G)的单链寡核苷酸，铅离子可以促进寡核苷酸形成G-四联体机构，结合G-四联体的相关特性选择合适的信号输出方法，可达到检测铅的目的。寡核苷酸具有合成成本低，稳定性好等特点，因而成为研究的热点。石英晶体微天平(QCM)具有灵敏度高，体积小、设备简单、操作简便、检测费用低、能实时在线检测等优点，若QCM直接用于铅离子检测，由于金属铅分子量比较小，检测灵敏度不高。利用功能核酸形成G-四联体与QCM技术相结合检测铅离子的方法尚没有报道。因此，结合功能核酸形成G-四联体，利用QCM的高灵敏度实现铅离子的检测研究非常必要。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种抗干扰能力强、灵敏度高的用于检测铅的生物传感器及检测方法。参见图1，本专利技术的检测原理为:以石英晶体微天平(QCM)金电极为测定电极，通过QCM金电极表面自组装巯基修饰的功能核酸1与带巯基的寡核苷酸修饰的纳米金3构建铅离子的检测体系。金电极的表面可以用6-巯基己醇2对其空位进行封闭。当检测体系中没有铅离子4时，纳米金3上的寡核苷酸与功能核酸1互补配对，电极表面质量发生明显变化，使其频率变小；当检测体系加入铅离子4后，铅离子4促使电极表面的功能核酸1形成G-四联体结构5，使得这部分功能核酸1不能与寡核苷酸互补配对，电极表面质量变化不明显，频率变化不显著，基于QCM电极的频率信号与铅离子浓度成反比，则通过确定电极的频率信号实现铅离子的定量检测。根据本专利技术的第一方面，提供一种检测铅的生物传感器，包括测定电极和测定溶液两部分。其中，测定电极的制备过程如下:将镀金石英晶振片用piranha溶液(浓H2S0# 30 % Η 202按照3:1 (V/V)的比例混合均匀)清洗，干燥后，将经三-(2-甲酰乙基)膦盐酸盐(TCEP)还原的功能核酸溶液滴在晶振片上反应完成自组装，为封闭晶振片的空位，再滴加6-巯基己醇反应，清洗干燥后，冷减备用。其中，测定溶液的制备过程如下:将四氯金酸加热至沸腾，加入柠檬酸二钠溶液，加热反应后，冷却至室温，制得纳米金溶液，加入经巯基修饰的寡核苷酸，反应后，加入Tris-HCl缓冲液老化，使寡核苷酸在纳米金表面呈线性排列；最后离心沉淀，并使用HEPES缓冲液清洗，再经离心后将沉淀物分散于HEPES缓冲溶液中，冷藏备用。在本专利技术的一个具体实施例中，所述的功能核酸序列为:5’ -SH-TTTTTTACCCAGGGTGGGTGGGTGGGT-3’(QPB1)，所述的寡核苷酸序列为:5’ -SH-TTTTTTACCCACCCA-3’(QPB2)。在本专利技术的一个优选实施例中，所制得的纳米金溶液中金粒子的平均粒径为12±3nm。该粒径的金粒子在溶液中具有很好的分散性和悬浮性，易与寡核苷酸进行结合。在本专利技术的另一个优选实施例中，其中测定溶液中纳米金与寡核苷酸的摩尔比为1:50?100。在该比例范围内，能确保测定溶液中的纳米金粒子充分与寡核苷酸结合。根据本专利技术的第二方面，提供一种利用上述的生物传感器检测铅离子的检测方法，包括步骤:(1)将所述测定电极在QCM上检测其频率，记做F。；(2)在所述测定电极上滴加预先配置好的已知浓度的铅离子标准溶液，反应后，铅离子使得晶振片上的功能核酸形成稳定的G-四联体结构，经清洗干燥后，再滴加所述测定溶液，反应后，纳米金上的寡核苷酸与晶振片上未结合铅离子的功能核酸互补配对，将纳米金牢固吸附于晶振片表面，清洗干燥后，利用QCM检测其频率，记做F1;重复上述步骤，获得一系列不同浓度的铅离子标准溶液对应的晶振片的频率变化Λ F，计算Λ F =匕-Fi，并以不同浓度的铅离子与对应的频率变化作图，绘制标准曲线；(3)将待测溶液按步骤(2)所述的步骤测试其AF ;比照标准曲线得出待测溶液中的铅离子浓度。在本专利技术的一个具体实施例中，所述的标准曲线为:AF = -0.0708CPb+17.035，其中:Λ F为频率变化，单位为Hz，CPb铅离子浓度，单位为nM。本专利技术的生物传感器用来测定水体铅离子的浓度范围为0_200nM，最低检测限为0.5nM0本专利技术提供的生物传感器及检测方法，操作简单、成本低廉、检测灵敏度高、特异性强，可以实现对铅离子的高效检测。【附图说明】图1为根据本专利技术的检测原理示意图，其中1:功能核酸，2:6_巯基己醇，3:修饰的纳米金，4:铅离子，5:G-四联体结构；图2为不同浓度的铅离子引起的频率变化标准曲线图；图3为干扰离子引起的频率变化与空白频率变化的差值；图4a为晶振片与铅反应前的SEM电镜图；图4b为晶振片与铅反应后的SEM电镜图。【当前第1页1 2 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测铅的生物传感器，包括测定电极和测定溶液两部分；其中，测定电极的制备过程如下：将镀金石英晶振片用piranha溶液清洗，干燥后，将经TCEP还原的功能核酸溶液滴在晶振片上反应完成自组装，为封闭晶振片的空位，再滴加6‑巯基己醇反应，清洗干燥后，冷藏备用；其中，测定溶液的制备过程如下：将四氯金酸加热至沸腾，加入柠檬酸二钠溶液，加热反应后，冷却至室温，制得纳米金溶液，加入经巯基修饰的寡核苷酸，反应后，加入Tris‑HCl缓冲液老化，使寡核苷酸在纳米金表面呈线性排列；最后离心沉淀，并使用HEPES缓冲液清洗，再经离心后将沉淀物分散于HEPES缓冲溶液中，冷藏备用。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：袁敏，王兴龙，徐斐，于劲松，曹慧，
申请(专利权)人：上海理工大学，
类型：发明
国别省市：上海;31