本发明专利技术涉及一种人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，包括以下步骤：获取骨髓间充质干细胞，采用三维细胞培养支架于培养基中进行体外培养；其中，所述三维细胞培养支架是由胶原支架、纳米晶胶原基骨和脱细胞软骨三者中的至少两种组合制成的。采用两种及以上的三维细胞培养支架以人工模拟骨髓微环境进行培养骨髓间充质干细胞的方法，避免了单一的三维细胞培养支架生物相容性较低、细胞黏附性能弱等问题，从而可真正实现骨髓间充质干细胞的三维培养，不仅能够提高骨髓间充质干细胞的活性，而且还能够提高骨髓间充质干细胞的扩增率。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及细胞工程
，特别涉及一种人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充 质干细胞的方法。
技术介绍
骨髓间充质干细胞（Mesenchymai stem cells，MSCs)，是在骨髓中的一种类似成 纤维细胞的一类细胞，具有多方向分化潜能，可以向骨组织、软骨组织、皮肤、造血干细胞支 持介质、骨骼肌细胞及心肌细胞转化。自体骨髓间充质干细胞还具有取材方便、无免疫原 性、具有多向分化潜能、合乎伦理学要求并且无致瘤性，具有其它干细胞不可比拟的优势， 因此，探讨MSCs体外大量扩增具有深远意义。目前骨髓间充质干细胞的体外扩增多采用二维培养方式进行的，也有部分采用三 维细胞培养支架进行培养，但均是采用单一的三维细胞培养支架，由于单一的三维细胞培 养支架存在机械性能弱，不稳固，且生物相容性差等问题，因此，在培养过程中，容易从三维 细胞培养支架的三维培养方式转变成二维培养方式，使得骨髓间充质干细胞黏附性差，细 胞活性差，且扩增不明显。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是，针对现有技术中采用单一的三维支架培养骨髓间 充质干细胞存在生物相容性较低、细胞黏附性能弱等造成骨髓间充质干细胞扩增率不高、 细胞活性差等缺陷，提供一种能够采用两种及以上的三维支架组合来模拟骨髓微环境进行 骨髓间充质干细胞的培养方法。 本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种人工模拟骨髓微环境培养 骨髓间充质干细胞的方法，包括以下步骤： 获取骨髓间充质干细胞，采用三维细胞培养支架于培养基中进行体外培养； 其中，所述三维细胞培养支架是由胶原支架、纳米晶胶原基骨和脱细胞软骨三者 中的至少两种组合制成的。 在本专利技术提供的中，获取骨髓 间充质干细胞的步骤包括：采集骨髓，肝素抗凝，在percoll分离液中离心，取中层单核细 胞，PBS缓冲液离心洗涤，弃上清液，即收获原代骨髓间充质干细胞。 在本专利技术提供的中，获取骨髓 间充质干细胞的步骤还包括对原代骨髓间充质干细胞进行传代培养的过程，包括以下步 骤：将原代骨髓间充质干细胞浓度调整至IX IO6~IX 10 8个/25ml，加入所述培养基进行 培养；当细胞生长到融合时，PBS漂洗，加入胰蛋白酶，见胞质回缩，细胞间隙增大后，加入 含胎牛血清的DMEM培养基终止消化，按1 :2~1 :3比例接种进行传代培养至细胞生长到融 合，继续传代至获得第三代骨髓间充质干细胞。 在本专利技术提供的中，采用三维 细胞培养支架进行体外培养的步骤为：取三维细胞培养支架复溶，取第三代骨髓间充质干 细胞，PBS清洗，胰酶-EDTA消化，以I X IO8~I X 10 wL 1细胞浓度与复溶后三维细胞培养 支架共同接种于所述培养基中进行培养。 在本专利技术提供的中，三维细胞 培养支架复溶过程中，还添加有助溶剂。 在本专利技术提供的中，所述助溶 剂为乙酸或乙醇，且所述助溶剂的质量分数为5% -15%。 在本专利技术提供的中，所述培养 基为血清培养基，且所述血清培养基中添加有10 6~10 smol/L的氢化可的松、80-120U/ml 的青霉素及80-120mg/ml的链霉素。 在本专利技术提供的中，所述胶原 支架的制备过程，包括以下步骤： 取胶原溶于乙酸溶液中，获得胶原溶胀液；所述胶原溶胀液经真空脱泡处理后， 于-5°c~-198°c温度下冷冻0. 5~2小时，然后再进行冻干即可。 在本专利技术提供的中，所述纳米 晶胶原基骨的制备过程，包括以下步骤： 制备钙磷比为I. 0~2. 5的溶液，加入I型胶原溶液中，离心去上清，冷冻干燥，再 加入聚乳酸即复合形成纳米晶胶原基骨三维框架材料。 在本专利技术提供的中，所述脱细 胞软骨的制备过程，包括以下步骤： 取关节软骨浸泡于含有蛋白酶抑制剂的PBS缓冲液中，经粉碎、梯度离心制成软 骨微丝，经脱细胞处理后，离心冲洗，加入DNA酶和RNA酶消化后，重复离心，收获沉淀物即 脱细胞软骨。 实施本专利技术提供的，可以达到 以下有益效果：通过采用胶原支架、纳米晶胶原基骨和脱细胞软骨中的两种或两种以上的 组合作为三维细胞培养支架，不仅能够维持模拟骨髓微环境的三维多孔结构，而且提高了 三维细胞培养支架的生物相容性，提高了骨髓间充质干细胞的吸附能力及生长增殖能力 等，且本专利技术提供的三维细胞培养支架还能够释放出有利于骨髓间充质干细胞生长的细胞 因子及营养物等，从而提高了骨髓间充质干细胞的增殖率及细胞活性，解决了现有技术中， 采用单一三维细胞培养支架培养骨髓间充质干细胞存在支架机械性能弱等缺陷造成细胞 增殖率低、易死亡等问题。【具体实施方式】 为解决现有技术中采用单一的三维细胞培养支架培养骨髓间充质干细胞存在细 胞活性差，增殖率低等缺陷，本专利技术的创新点在于提供一种采用两种及以上的三维细胞培 养支架以人工模拟骨髓微环境进行培养骨髓间充质干细胞的方法，避免了单一的三维细胞 培养支架生物相容性差、细胞黏附性弱等问题，从而可真正实现骨髓间充质干细胞的三维 培养，不仅能够提高骨髓间充质干细胞的活性，而且还能够提高骨髓间充质干细胞的扩增 率。 具体地，本专利技术提供的，包括 以下步骤： S1、获取骨髓间充质干细胞； S2、采用三维细胞培养支架于培养基中进行骨髓间充质干细胞的体外培养；其中， 三维细胞培养支架是由胶原支架、纳米晶胶原基骨和脱细胞软骨三者中的至少两种组合制 成；胶原支架、纳米晶胶原基骨和脱细胞软骨均具有良好的机械性能，在体外培养过程中降 解率较低或无降解变形，能够保留培养前的结构；但三者在单独使用时，存在生物相容性较 低，细胞黏附率较低，生长增殖较缓慢，增值率较低的缺陷；本专利技术通过长期大量实验证明， 将胶原支架、纳米晶胶原基骨和脱细胞软骨任意组合制成三维细胞培养支架，能够促进三 维细胞培养支架的生物相容性，促进细胞黏附，增加细胞生长面积，从而提高了细胞生长增 殖速率，提高了细胞增值率。 进一步地，步骤Sl中还包括原代骨髓间充质干细胞的获取，及原代骨髓间充质干 细胞的传代培养，具体为： S11、原代骨髓间充质干细胞的获取： 采集骨髓，肝素抗凝，在percoll分离液中离心，取中层单核细胞，加入PBS缓冲 液，离心洗涤，弃上清液，即当前第1页1 2 3 4 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：获取骨髓间充质干细胞，采用三维细胞培养支架于培养基中进行体外培养；其中，所述三维细胞培养支架是由胶原支架、纳米晶胶原基骨和脱细胞软骨三者中的至少两种组合制成的。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：曾宪卓，鲁菲，
申请(专利权)人：深圳爱生再生医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44
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